L'RNA modificato è un nuovo metodo per il trasferimento genico al cuore e ad altri organi. Questo protocollo fornirà un approccio accurato per fornire i geni desiderati transitoriamente al cuore, post infarto del miocardio. Questo metodo non è limitato all'infarto del miocardio, ma può anche essere applicato alla riperfusione di ischemia e ai modelli di costrizione aortica trasversale.
L'RNA modificato viene utilizzato in diversi studi clinici sull'uomo. Tuttavia, non esiste un protocollo standardizzato per il gene trasferito nel cuore usando questo metodo. La dimostrazione visiva consentirà ai ricercatori di iniettare correttamente RNA modificato in siti appropriati nel cuore.
A dimostrare la procedura saranno Ajit Magadum, un post-dottorato, ed Elena Chepurko un supervisore animale del nostro laboratorio. Sulla base della concentrazione del modRNA precedentemente preparato, calcolare il volume di modRNA necessario per un'iniezione di 100 microgrammi. Produce volumi uguali di soluzioni di saccarosio e citrato.
Quindi aggiungere il volume calcolato di modRNA e una soluzione salina sufficiente per portare il volume di iniezione a 60 microlitri. Dopo aver anestetizzato l'animale, posizionarlo lato ventrale verso l'alto, con la bocca rivolta verso lo sperimentatore. Quindi, per mantenere una via d'aria aperta eseguendo l'intubazione intratracheale, estrarre delicatamente la lingua.
Regolare l'angolo del collo per raddrizzare il percorso di intubazione e spingere la cannula di intubazione. Osservare il movimento toracico del topo per verificare che entrambi i polmoni ricevano ossigeno. La frequenza respiratoria dovrebbe essere di circa 120 respiri al minuto.
Per iniziare la legatura LAD, ruotare il mouse con attenzione sul lato destro. sollevare la pelle ed eseguire una toracotomia laterale sinistra tra la terza e la quarta costola. Aprire attentamente il torace, senza toccare i polmoni con oggetti appuntiti.
Posizionare i retrattiri nell'incisione per mantenere aperta la cavità toracica, fornendo una visione chiara del cuore. Quindi, spostare i polmoni sul bordo dell'incisione e rimuovere la parte del sacco pericardico che copre il cuore. Identificare attentamente il LAD, un vaso rosso chiaro intenso, situato tra l'arteria polmonare e il padiglione auricolare sinistro.
Legare il LAD prossimale con un'unica sutura di seta. Utilizzando una siringa per insulina, fornire un totale di 60 microlitri della soluzione di modRNA al cuore. Iniettare 20 microlitri per via intramuscolare, in tre siti diversi.
Un sito su ciascun lato della legatura e uno all'apice del cuore. Il modo migliore per iniettare l'RNA modificato nei siti corretti, è osservare lo scolorimento del tessuto al microscopio, dopo l'occlusione del LAD. Anche se iniettato, non andare troppo in profondità nel tessuto per raggiungere le camere cardiache nella circolazione.
Chiudere l'incisione toracica a strati. Il primo uso fu 6-0 suture da corsa in seta per adattare le costole. Quindi usa 5-0 suture da corsa in seta per chiudere la pelle.
Per la fase di recupero, rimuovere la cannula e consentire la respirazione spontanea. Posizionare l'animale su una pastiglia riscaldante fino a quando non riprende conoscenza. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non è completamente sveglio.
Per gestire il dolore postchirurgico, iniettare buprenorfina per via sottocutanea a intervalli di 12 ore per tre giorni. A una dose di 0,1 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo. 24 ore dopo la legatura del LAD e l'iniezione di modRNA luciferasi nei topi CFW, la trasfezione è stata convalidata controllando l'espressione proteica della luciferasi utilizzando un sistema di imaging a bioluminescenza.
Il segnale luciferasi può essere chiaramente rilevato nelle immagini che confrontano i topi di controllo, con topi iniettati con modRNA luciferasi. La quantificazione del segnale luciferasi mostra un'espressione proteica significativamente più elevata nei topi trattati che nei topi di controllo. L'espressione cre modRNA è stata convalidata controllandone la traduzione e la bio distribuzione nei topi transgenici ROSA26 mTmG.
24 ore dopo l'intervento chirurgico e l'iniezione di cre modRNA, le arti sono state fissate ed elaborate per l'immunostaining con marcatore di cardiomiociti, troponina cardiaca I e marcatore di nuclei DAPI. L'espressione cre di successo era evidente a causa della comparsa di cardiomiociti di colore verde. Un'immagine unita mostra le celle attivate da Cre intorno ai due siti di iniezione visibili.
Il blu è la macchia nucleare DAPI. La piattaforma di RNA modificata può fornire un singolo gene o combinazioni geniche in varietà di organi. E quindi può essere utilizzato per scopi terapeutici, come correggere i disturbi genetici o attivare meccanismi benefici nel corpo.
L'esclusiva farmacocinetica dell'RNA modificato ci consente di valutare la funzione genica immediatamente dopo la sua iniezione. Ciò consente al ricercatore di indirizzare i percorsi di segnalazione, che vengono alterati nelle prime ore di infarto.
