L’ARN modifié est une nouvelle méthode de transfert de gènes vers le cœur et d’autres organes. Ce protocole fournira une approche précise de la livraison des gènes désirés transitoirement au cœur, après l’infarctus du myocarde. Cette méthode ne se limite pas à l’infarctus du myocarde, mais peut également être appliquée à la reperfusion ischémique et aux modèles transversaux de constriction aortique.
L’ARN modifié est utilisé dans plusieurs essais cliniques sur l’homme. Cependant, il n’existe pas de protocole normalisé pour le gène transféré dans le cœur en utilisant cette méthode. La démonstration visuelle permettra aux chercheurs d’injecter correctement de l’ARN modifié à des endroits appropriés dans le cœur.
Ajit Magadum, boursier postdoctoral, et Elena Chepurko, superviseure des animaux de notre laboratoire, démontreront la procedule. Basé sur la concentration de l’précédemment préparé à modRNA, calculer le volume de modRNA nécessaire pour une injection de 100 microgrammes. Fait des volumes égaux de solutions de saccharose et de citrate.
Ajoutez ensuite le volume calculé de modRNA, et suffisamment de solution saline pour porter le volume d’injection à 60 microlitres. Après anesthésier l’animal, placez-le côté ventral vers le haut, la bouche orientée vers l’expérimentateur. Ensuite, pour maintenir une voie aérienne ouverte en effectuant une intubation intratrachéale, retirez doucement la langue.
Ajustez l’angle du cou pour redresser le chemin d’intubation et poussez dans la canule d’intubation. Observez le mouvement thoracique de la souris pour vérifier que les deux poumons reçoivent de l’oxygène. Le taux respiratoire devrait être d’environ 120 respirations par minute.
Pour commencer la ligature lad, tournez soigneusement la souris sur son côté droit. soulever la peau, et effectuer une thoracotomie côté gauche entre les troisième et quatrième côtes. Ouvrez soigneusement le thorax, sans toucher les poumons avec des objets tranchants.
Placez les rétracteurs dans l’incision pour garder la cavité thoracique ouverte, offrant une vue claire du cœur. Ensuite, déplacez les poumons vers le bord de l’incision, et retirez la partie du sac péricardique qui recouvre le cœur. Identifiez soigneusement le LAD, un récipient rouge clair profond, situé entre l’artère pulmonaire et l’auricle gauche.
Ligate le LAD proximal avec une seule suture de soie. À l’aide d’une seringue à insuline, fournir un total de 60 microlitres de la solution modRNA au cœur. Injecter 20 microlitres par voie intramusculaire, à trois sites différents.
Un site de chaque côté de la ligature et un dans l’apex du cœur. La meilleure façon d’injecter l’ARN modifié dans les bons emplacements, est d’observer la décoloration du tissu au microscope, après l’occlusion de LAD. Aussi lorsqu’il est injecté, ne pas aller trop profondément dans le tissu pour atteindre les chambres du cœur dans la circulation.
Fermer l’incision thoracique en couches. La première utilisation a été 6-0 sutures de course de soie pour adapter les côtes. Ensuite, utilisez des sutures de course de soie 5-0 pour fermer la peau.
Pour la phase de récupération, retirer la canule et permettre une respiration spontanée. Placez l’animal sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’il reprenne conscience. Ne laissez pas l’animal sans surveillance tant qu’il n’est pas complètement éveillé.
Pour gérer la douleur postsurgical, injectez la buprénorphine sous-cutanée à intervalles de 12 heures pendant trois jours. À une dose de 0,1 milligramme par kilogramme de poids corporel. 24 heures après ligature de LAD et injection du modRNA de luciferase chez les souris de CFW, la transfection a été validée en vérifiant l’expression de protéine de luciferase utilisant un système d’imagerie de bioluminescence.
Le signal de luciferase peut être clairement détecté dans les images comparant des souris témoins, aux souris injectées avec le modRNA de luciferase. La quantification du signal de luciferase montre une expression protéique significativement plus élevée chez les souris traitées que chez les souris témoins. L’expression de Cre modRNA a été validée en vérifiant sa traduction et sa bio distribution chez les souris transgéniques ROSA26 mTmG.
24 heures après chirurgie et injection de modRNA de cre, les arts ont été fixés et traités pour l’immunostaining avec le marqueur de cardiomyocyte, la troponine cardiaque I, et le marqueur de noyaux DAPI. L’expression réussie de cre était évidente due à l’aspect des cardiomyocytes colorés verts. Une image fusionnée montre des cellules activées cre autour des deux sites d’injection visibles.
Le bleu est la tache nucléaire DAPI. La plate-forme modifiée d’ARN peut fournir un gène unique ou des combinaisons de gène dans la variété des organes. Et peut donc être utilisé à des fins thérapeutiques, telles que la correction des troubles génétiques, ou l’activation de mécanismes bénéfiques dans le corps.
La pharmacocinétique unique de l’ARN modifié nous permet d’évaluer la fonction génétique immédiatement après son injection. Cela permet au chercheur de cibler les voies de signalisation, qui sont modifiées dans les premières heures de l’infarctus.
