Este protocolo de la parafinización seguido de la recuperación de antígenos de secciones aórticas incrustadas en parafina puede ser una herramienta útil para estudiar el papel de las trampas tricelulares neutrófilas en la trombosis felina. La detección de trampas tricelulares neutrófilas por inmunofluorescencia en tejido fijo e incrustado en parafina, es superior a los stents histológicos convencionales como HNE, ya que permite la detección simultánea de ADN más seguro y proteínas extracelulares. Este protocolo se puede utilizar en otro tipo de trombos y en otras especies veterinarias.
La identificación de trampas extracelulares de neutrófilos dentro de trombos arteriales felinos sugiere que pueden desempeñar un papel en la trombosis en gatos. Los protocolos presentados aquí son directrices. Recomendamos encarecidamente a los investigadores que ajusten la duración y las condiciones del proceso de recuperación de antígenos para producir una señal satisfactoria.
Para utilizar un sistema automatizado para realizar la desparafinanciación y la rehidratación de las secciones en los portaobjetos de vidrio, coloque los portaobjetos de vidrio en bastidores. Sumérgete completamente en solución salina al 100 por ciento durante tres minutos. Repita este paso dos veces.
No enjuague entre pasos. Sumérgete completamente en concentraciones de disminución de etanol a temperatura ambiente tres veces durante tres minutos cada una. Sumérgete completamente en agua desionizada durante dos minutos y repite una vez más.
Después del tratamiento con TBST, llene el depósito con agua desionizada calentada a 100 grados centígrados. Deje que la cámara del vapor se equilibre durante 20 minutos. En una placa de calor, caliente la solución de recuperación de antígenos disponible comercialmente que contiene Tris y EDTA a pH 9.0 a 95 a 97 grados Celsius.
Asegúrese de que no hierva. Suberge los portaobjetos completamente en la solución de recuperación de antígenos calentados y continuar la aplicación de calefacción externa a través del vapor durante 20 minutos. A continuación, lave los portaobjetos tres veces con TBST durante cinco minutos.
Ahora, coloque las secciones en el búfer de bloqueo 1. Incubar durante dos horas a temperatura ambiente bajo un suave balanceo entre 30 y 50 rpm. Sin lavado, aplique inmediatamente 100 microlitros de anticuerpos de histona citrulinado citrulinado policlonal diluido de conejo directamente sobre el portaobjetos H3 en el portaobjetos.
Coloque un resbalón de cubierta en cada sección para permitir una distribución uniforme de la mezcla de anticuerpos. Incubar durante 12 a 16 horas a cuatro grados centígrados con un suave balanceo. Después de eso, lave los portaobjetos tres veces con TBST durante cinco minutos cada vez.
Para aplicar anticuerpos, utilice una pipeta y distribuya uniformemente 100 microlitros de anticuerpos anti-conejo de cabra conjugados con Alexa Fluor 488. Cubra los portaobjetos con papel de aluminio e incubar los portaobjetos durante una hora a temperatura ambiente bajo un suave balanceo. Después de lavar con TBST según el manuscrito, incubar las secciones en el tampón de bloqueo 2 durante la noche a cuatro grados centígrados bajo suave balanceo.
Protéjase de la luz. Lavar con TBST tres veces durante cinco minutos cada vez. Bloquee las secciones en el tampón de bloqueo 3 como se hizo anteriormente a temperatura ambiente durante dos horas bajo un suave balanceo.
Incubar las secciones con anticuerpos de elastasa anti-humano de conejo con cuñalo con la biotina a cuatro grados Celsius durante 12 a 16 horas como se describió anteriormente. Después de lavar con TBST incubar los toboganes con Alexa Fluor 594 Streptavidin Conjugate durante una hora a temperatura ambiente. Después de eso, lavar con TBST una vez durante cinco minutos.
Aplique 100 microlitros de la mezcla de solución Autofluorescense Quenching directamente en las secciones durante un minuto según las instrucciones del fabricante. Lave inmediatamente los portaobjetos con TBST seis veces durante 10 minutos cada vez. Cubra cada diapositiva con 100 microlitros de 300 DAPI nanomolares durante cinco minutos en la oscuridad.
A continuación, lave con TBST cinco veces durante tres minutos cada vez. Aplique una gota de medio de montaje antifada directamente sobre el portaobjetos de vidrio que rodea la sección. Coloque un resbalón de cubierta suavemente sobre la sección sin crear burbujas.
Deje que las muestras se curen durante la noche en la oscuridad a cuatro grados centígrados. Para localizar el trombo, escanee cránidamente a caudalmente a lo largo de la longitud de la aorta, la bifurcación aórtica y cada arteria femeral utilizando microscopía de contraste de fase con un objetivo de 10x. En primer lugar, examine las secciones en busca de ADN libre de células utilizando el canal DAPI con la excitación a 357 y 44 nanómetros.
Identificar la elastasa de neutrófilos extracelulares y la histona citrulinada H3 en los canales de proteína fluorescente roja y verde de Texas respectivamente. Mantenga un tiempo de exposición y ganancias constantes de cada canal a lo largo de la adquisición de imágenes para evitar la saturación en la intensidad de píxeles. Las trampas extracelulares de neutrófilos se identifican en base a la co-localización de la elastasa de neutrófilos, la histona citrulinada H3 y el ADN libre de células.
Usando hematoxilina y eosina mancha, y microscopía de campo brillante, trombos arteriales felinos consisten en glóbulos rojos, leucocitos, fibrina y plaquetas. Los GRAF aparecieron como redes de hilos púrpuras profundos de varias longitudes que rodean los eritrocitos y leucocitos cercanos. Utilizando este protocolo, la microscopía de inmunofluorescencia reveló grandes agregados de NPT compuestos de ADN libre de células, histona citrulinada extracelular H3 y elastasa neutrófilos.
Bajo contraste de fase en la microscopía inmune, un trombo se caracterizó como una estructura bien demarcada dentro del espacio vascular. Sin embargo, no se detectaron trombos en ninguna de las muestras de control. Esta figura demuestra una profunda autofluoresencia de elementos de coágulos como eritrocitos cuando se muestra en la longitud de onda de 488 nanómetros.
El breve enfriamiento de la autofluoresencia después del inmunoetiqueje aumentó significativamente la sensibilidad de la co-localización de proteínas y la detección de NET incluso en áreas con abundancia de eritrocitos. La duración de la fijación afecta a la inmunoreactividad de ciertos antígenos. Recomendamos fijar durante no más de 24 horas la deshidratación y la incrustación de parafina.
Alternativamente, el paraformaldehído libre de metanol se puede utilizar para limitar el artefacto por ácido fórmico y cetonas de la oxidación del formaldehído. Para evitar interferencias al utilizar anticuerpos primarios procedentes de la misma especie, incluimos un paso de bloqueo adicional para saturar los sitios de unión restantes en los anticuerpos secundarios. Los investigadores deben incluir controles negativos consistentes en anticuerpos isotipos, exclusión de anticuerpos primarios y pasos de inmunoetiquedo y controles biológicos de gatos sin trombosis.
La autofluoresncia de los límites tisulares del trombo puede martillar la identificación microscópica de las trampas extracelulares de neutrófilos. El investigador puede minimizar la fluorescencia mediante el uso de fluoróforos de color rojo lejano. Esta técnica puede ser una herramienta valiosa para el estudio de trampas extracelulares de neutrófilos en otras especies veterinarias.
Esto puede proporcionar una mejor comprensión de la fisiopatología de la trombosis.
