Este método descreve o caminho completo do projeto, montagem e caracterização de micelas complexas polieletrólitos que são nanopartículas que são formadas a partir da auto-montagem de polímeros carregados de forma oposta. Alguns dos principais desafios com a automontagem polieletrico são evitar armadilhas cinéticas e caracterizar as nanopartículas. A técnica de ressarbramento de sal que descrevemos permite o conjunto repetitivo de micelas com baixa dispersão tanto em tamanho quanto em forma e descrevemos métodos de caracterização, incluindo dispersão de luz, dispersão de raios-X de pequeno ângulo e microscopia eletrônica.
A entrega de ácidos nucleicos terapêuticos é um desafio de longa data para a nanomedicina. Estes micelas complexos polieletrolitos aproveitam a forte carga negativa do ácido nucleico para sequestra-los no núcleo da micelle onde a coroa de polímero neutro os protege de núcleos e resposta imune. O método de montagem deve ser aplicável a qualquer tipo de polímeros carregados.
Testamos-os com vários polianões e policações e o método de caracterização deve ser aplicável a quaisquer nanopartículas auto-montadas, incluindo nanopartículas surfactantes e outros sistemas movidos a hidrofobicamente. Comece incubando a solução de oligonucleotídeo a 70 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, esfrie-o por 15 minutos à temperatura ambiente para resfriar termicamente os ácidos nucleicos, em seguida, adicione 40 microliters de 20 milmolar de concentração carregada diblock copolymer.
Vórtice a solução imediatamente e incuba-a por cinco minutos em temperatura ambiente. Para realizar o sal anneal, adicione a solução de cloreto de sódio à solução de oligonucleotídeo para uma concentração final de um molar e vórtice por 10 segundos em velocidade máxima. Incubar a mistura por 10 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, proceder com o carregamento no cartucho de diálise.
Antes do carregamento, rotule os cartuchos com marcador permanente e mergulhe-os em tampão por pelo menos dois minutos para hidratar as membranas. Remova a tampa torcendo no sentido anti-horário e carregue a amostra usando uma ponta de pipeta de carregamento de gel. Aperte suavemente a membrana para remover o excesso de ar e substitua a tampa.
Coloque os cartuchos em 1X PBS 0,5 banho de diálise de cloreto de sódio molar certificando-se de que eles estão flutuando com ambas as membranas expostas ao banho. Após 24 horas, transfira os cartuchos para 1X PBS e mergulhe-o por mais 24 horas. Após a diálise final, recupere a amostra removendo os cartuchos do banho, removendo a tampa e removendo a amostra com uma ponta de pipeta de carregamento de gel.
Coloque a amostra em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro limpo e leve à geladeira até estar pronta para usar. Prepare a amostra no instrumento DLS de acordo com as instruções do manuscrito e, em seguida, adquira dados por pelo menos um minuto certificando-se de que a taxa de contagem é constante durante todo o tempo de aquisição. Examine os dados de autocorrelação.
A linha de base de longa duração deve ser plana e a curva de autocorrelação deve ser suave com dispersão mínima. O ruído nos dados pode ser melhorado adquirindo mais dados. Para realizar a redução e análise de dados usando o Irena, comece importando micelle em conjuntos de dados de fundo.
Plote a amostra e o fundo juntos em uma escala de log-log e calcule a proporção amostra-fundo e verifique a assíntota Q alta. Calcule a razão média sobre esta faixa Q e use a macro de manipulação de dados para dimensionar o fundo com a razão calculada. Em seguida, plote o sinal subtraído de fundo sobre Q e salve os dados com um novo nome certificando-se de não substituir os dados originais.
Abra a macro de modelagem e, em seguida, carregue e plote os dados subtraídos de fundo. Para encontrar um modelo aproximado para a superfície externa da micela complexa polieletrílica, ou PCM, selecione o fluxo para faixa Q moderada nos controles de dados, certificando-se de incluir oscilações se estiverem presentes. Nos controles de modelo, selecione a primeira população dispersante e certifique-se de que ela é a única em uso.
Selecione a distribuição de tamanho para o modelo, escolha o tipo de distribuição desejado e selecione o fator de forma. Este exemplo é para um cilindro flexível que deve ser adicionado manualmente sob o fator de forma do usuário. Baixe e adicione o fator de forma flexível do cilindro, em seguida, insira os nomes da função e os valores iniciais para os parâmetros um e dois que correspondem ao comprimento do cilindro e do comprimento kuhn, respectivamente.
Estes cilindros são mais longos do que podem ser resolvidos pelo SAXS para que o parâmetro de comprimento do cilindro seja fixado a um grande valor. Defina parâmetros iniciais para a pesquisa inserindo valores na escala, tamanho médio e campos de largura. Em seguida, clique em calcular o modelo para desenhar o fator de forma resultante.
Uma vez encontrados parâmetros razoáveis, clique no modelo fit para executar um mínimo não linear de quadrados adequados aos dados. Em seguida, modele a dispersão dos polímeros individuais dentro do núcleo PCM. Ajuste os controles de dados para selecionar a faixa Q onde ocorre o excesso de dispersão que normalmente está na faixa moderada a alta.
Adicione uma segunda população dispersante e certifique-se de que é a única em uso. Selecione o nível unificado para o modelo, ajuste os fatores G e RG do GDA para garantir que o modelo não preveja dispersão excessiva no Q baixo e use o PB fit entre os cursores macro para obter um palpite inicial para esses parâmetros. Quanto ao fator de forma, realize um ajuste não linear para o modelo de nível unificado.
Se houver um pico de difração, adicione um terceiro modelo para o pico de difração na faixa Q de interesse. Uma vez que valores de ajuste aproximados são obtidos para as populações dispersantes individuais, ligue os três juntos e otimize o ajuste combinado. Por fim, verifique se cada valor permanece fisicamente razoável e salve o ajuste selecionando a loja na pasta.
O resultado deste procedimento deve ser um modelo composto que descreve os dados de dispersão de raios-X de pequeno ângulo bem sobre uma grande variedade de escalas de tamanho. Este protocolo foi usado para projetar, montar e caracterizar micelas complexas de ácido nucleico ou PCMs. O tamanho do núcleo de Miceelle é impulsionado principalmente pelo comprimento do bloco carregado do copolímero do bloco e é em grande parte independente do comprimento do homopolímero.
Dados dinâmicos de dispersão de luz foram adquiridos para PCMs esféricos formados a partir de copolímeros de blocos relativamente longos em oligonucleotídeos de um único fio. A função de correção automática decaiu para um valor plano com a escala de tempo única resultando no pico de tamanho único na distribuição de tamanho repIS. A dispersão complexa de raios-X de anjo pequenos ou espectros de intensidade de SAXS podem ser encaixadas com precisão, combinando modelos para as múltiplas correlações espaciais que estão presentes e a dispersão de luz multiangle pode ser usada para estender as medições de dispersão para escalas de comprimento mais longas.
PcMs de morfologia variada também podem ser imagens com microscopia eletrônica para verificar se raios e forma do núcleo são consistentes com os valores obtidos a partir da montagem de dados SAXS. Ao ajustar os dados do SAXS, é importante explicar cada recurso de dispersão e usar métodos complementares como o TEM para ter certeza de que você está usando o fator de forma correto.
