Questo metodo descrive il percorso completo della progettazione, assemblaggio e caratterizzazione di micelle complesse polielettroliti che sono nanoparticelle che si formano dall'auto-assemblaggio di polimeri caricati in modo opposto. Alcune delle principali sfide con l'auto-assemblaggio dei polielettroliti sono evitare trappole cinetiche e caratterizzare le nanoparticelle. La tecnica di ricottura del sale che descriviamo consente l'assemblaggio ripetibile di micelle a bassa dispersione sia in termini di dimensioni che di forma e descriviamo metodi di caratterizzazione tra cui scattering della luce, scattering a raggi X ad angolo ridotto e microscopia elettronica.
Fornire acidi nucleici terapeutici è una sfida di lunga data per la nanomedicina. Queste micelle complesse polielettroliti sfruttano la forte carica negativa dell'acido nucleico per sequestrarle nel nucleo della micelle dove la corona polimerica neutra le protegge dalle nucleasi e dalla risposta immunitaria. Il metodo di assemblaggio deve essere applicabile a qualsiasi tipo di polimero carico.
Li abbiamo testati con diversi polianioni e policationi e il metodo di caratterizzazione dovrebbe essere applicabile a tutte le nanoparticelle auto-assemblate tra cui nanoparticelle tensioattiva e altri sistemi idrofobicamente guidati. Iniziare incubando la soluzione oligonucleotosa a 70 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, raffreddarlo per 15 minuti a temperatura ambiente per ricottura termica degli acidi nucleici, quindi aggiungere 40 microlitri di copolimero di blocco a concentrazione caricata da 20 millimolare.
Vortice immediatamente la soluzione e incubarla per cinque minuti a temperatura ambiente. Per eseguire la ricottura salina, aggiungere la soluzione di cloruro di sodio alla soluzione oligonucleotosa per una concentrazione finale di un molare e vortice per 10 secondi alla massima velocità. Incubare la miscela per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi procedere con il caricamento nella cartuccia di dialisi.
Prima del caricamento, etichettare le cartucce con marcatore permanente e immergerle nel tampone per almeno due minuti per idratare le membrane. Rimuovere il cappuccio torcendo in senso antiorario e caricare il campione utilizzando una punta della pipetta di caricamento del gel. Spremere delicatamente la membrana per rimuovere l'aria in eccesso e sostituire il cappuccio.
Mettere le cartucce nel bagno di dialisi al cloruro di sodio molare 1X PBS 0.5 assicurandosi che galleggiano con entrambe le membrane esposte al bagno. Dopo 24 ore, trasferire le cartucce in 1X PBS e immergerle per altre 24 ore. Dopo la dialisi finale, recuperare il campione rimuovendo le cartucce dal bagno, rimuovendo il tappo e rimuovendo il campione con una punta della pipetta di caricamento del gel.
Posizionare il campione in un tubo di microcentrifugo pulito da 1,5 millilitri e refrigera fino a quando non è pronto per l'uso. Preparare il campione nello strumento DLS in base alle indicazioni manoscritte, quindi acquisire i dati per almeno un minuto assicurandosi che il tasso di conteggio sia costante per l'intero tempo di acquisizione. Esaminare i dati di correzione automatica.
La linea di base a lungo termine dovrebbe essere piatta e la curva di autocorrelazione dovrebbe essere liscia con una dispersione minima. Il rumore nei dati può essere migliorato acquisendo più dati. Per eseguire la riduzione e l'analisi dei dati utilizzando Irena, iniziare importando micelle in set di dati in background.
Tracciare l'esempio e lo sfondo insieme su una scala log-log e calcolare il rapporto campione/sfondo e verificare l'asintoto Q elevato. Calcola il rapporto medio su questo intervallo Q e usa la macro di manipolazione dei dati per ridimensionare lo sfondo con il rapporto calcolato. Quindi tracciare il segnale sottratto in background su Q e salvare i dati con un nuovo nome assicurandosi di non sovrascrivere i dati originali.
Aprire la macro di modellazione, quindi caricare e tracciare i dati sottratti in background. Per trovare un modello approssimativo per la superficie esterna della micelle complessa polielettrolita, o PCM, selezionare il flusso per moderare l'intervallo Q nei controlli dati assicurandosi di includere oscillazioni se sono presenti. Nei controlli modello, selezionare la prima popolazione di scattering e assicurarsi che sia l'unica in uso.
Selezionate la distribuzione delle dimensioni per il modello, scegliete il tipo di distribuzione desiderato e selezionate il fattore di forma. Questo esempio è per un cilindro flessibile che deve essere aggiunto manualmente sotto il fattore di forma dell'utente. Scaricare e aggiungere il fattore di forma del cilindro flessibile, quindi inserire i nomi delle funzioni e i valori iniziali per i parametri uno e due che corrispondono rispettivamente alla lunghezza del cilindro e alla lunghezza di Kuhn.
Questi cilindri sono più lunghi di quelli che possono essere risolti da SAXS, quindi il parametro di lunghezza del cilindro è fissato a un valore elevato. Impostare i parametri iniziali per la ricerca immettendo i valori nei campi scala, dimensione media e larghezza. Quindi fare clic su calcola modello per disegnare il fattore di forma risultante.
Una volta trovati parametri ragionevoli, fare clic sul modello di adattamento per eseguire un minimo quadrato non lineare adatto ai dati. Successivamente, modellare la dispersione dei singoli polimeri all'interno del nucleo PCM. Regolare i controlli dati per selezionare l'intervallo Q in cui si verifica lo scattering in eccesso, che in genere si trova nell'intervallo da moderato a alto.
Aggiungere una seconda popolazione di scattering e assicurarsi che sia l'unica in uso. Selezionate il livello unificato per il modello, regolate i fattori GDA G e RG per garantire che il modello non predice uno scattering eccessivo a Q basso e utilizzate la macro FIT PB tra cursori per ottenere un'ipotesi iniziale per questi parametri. Per quanto riguarda il fattore di forma, eseguire un adattamento non lineare per il modello di livello unificato.
Se è presente un picco di diffrazione, aggiungere un terzo modello per il picco di diffrazione nell'intervallo Q di interesse. Una volta ottenuti valori di adattamento approssimativi per le singole popolazioni di scattering, accendere tutti e tre insieme e ottimizzare l'adattamento combinato. Infine, controlla che ogni valore rimanga fisicamente ragionevole e salva l'adattamento selezionando l'archivio nella cartella.
Il risultato di questa procedura dovrebbe essere un modello composito che descrive i dati di scattering a raggi X ad angolo ridotto ben su una vasta gamma di scale di dimensioni. Questo protocollo è stato utilizzato per progettare, assemblare e caratterizzare micelle complesse di polielettroliti ad acido nucleico o PCM. La dimensione del nucleo della micelle è principalmente guidata dalla lunghezza del blocco caricato del copolimero del blocco ed è in gran parte indipendente dalla lunghezza dell'omopolimero.
I dati dinamici di diffusione della luce sono stati acquisiti per PCM sferici formati da copolimeri a blocchi relativamente lunghi in brevi oligonucleotidi a singolo filamento. La funzione di autocorrelazione è decaduta in un valore piatto con la singola scala temporale con conseguente picco di dimensione singola nella distribuzione delle dimensioni repIS. Lo scattering a raggi X di piccoli angeli complessi o gli spettri di intensità SAXS possono essere adattati con precisione combinando modelli per le correlazioni spaziali multiple presenti e lo scattering della luce multiangle può essere utilizzato per estendere le misurazioni dello scattering a scale di lunghezza più lunga.
I PCM di morfologia variabile possono anche essere immagini con microscopia elettronica per verificare che i raggi e la forma del nucleo siano coerenti con i valori ottenuti adattando i dati SAXS. Quando si adattano i dati SAXS, è importante tenere conto di ogni funzione di scattering e utilizzare metodi gratuiti come TEM per assicurarsi di utilizzare il fattore di forma corretto.
