Este protocolo se puede utilizar para obtener un gran número de sensores y las células del fibroblasto motor y Schwann rápidamente. Las células obtenidas a través de este mensaje se pueden utilizar en el estudio de la regeneración nerviosa y enfermedades del sistema nervioso. Mostramos que la demostración puede representar lo experimental para controlar mejor el tiempo del paso digestivo diferencial y hacer que los pasos experimentales sean más fáciles de entender.
Para estallar use tijeras para hacer una incisión de tres centímetros, en la piel de la espalda. Retire la columna vertebral. Abra cuidadosamente el canal vertebral para exponer la médula espinal.
Encaje la médula espinal en una placa Petri de 60 milímetros, con tres a cuatro mililitros de solución de sal equilibrada D Hanks bajo un microscopio diseccionado, excediendo la raíz ventral y la raíz dorsal. Colóquelos en una solución de sal equilibrada de D Hanks helada. Después de retirar el HBSS, cortar los nervios en tres a cinco piezas milimétricas, con tijeras.
Añadir un mililitro de 0,25% de trippsina y transferir las piezas nerviosas a tubos de centrífuga de cinco mililitros. Incubar a 37 grados centígrados durante 18 a 20 minutos. A continuación, para detener la digestión, añadir de tres a cuatro mililitros de DMEM que contiene 10%suero bovino fetal.
Pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo suavemente unas 10 veces. Centrifugar a 800 veces G durante cinco minutos. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante.
Y re-suspender el precipitado en dos a tres mililitros de DMEM complementado con 10%FBS. Filtrar la suspensión celular a través de un filtro de malla 400, y luego utilizar la suspensión para inocular una placa Petri de 60 milímetros. Incubar los platos de Petri durante cuatro a cinco días a 37 grados centígrados, en presencia de 5% de dióxido de carbono.
Cuando el cultivo haya alcanzado el 90% de confluencia, lave las células una vez usando 1XPBS. Luego, para digerir las células Schwann, agrega un mililitro de 0.25%trypsin a 37 grados Celsius por plato de 60 milímetros. Después de ocho a 10 segundos a temperatura ambiente, detener la digestión, mediante la adición de tres mililitros de DMEM complementado con 10%FBS.
Para separar las células Schwann, sople suavemente sobre la celda con una pipeta. Verifique por microscopio que las células están desprendidas. Luego recoge el medio, que contiene las células Swan, y centrifuga a 800 veces G durante cinco minutos.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el precipitado en tres mililitros de medio. Utilice esta suspensión para inocular platos Petri de 60 milímetros sin revestir e incubar los platos a 37 grados centígrados durante 30 a 45 minutos. Marcas para el medio, que contendrá las células Schwann a un plato mediano recubierto de lisina Poly L, e incubar el plato a 37 grados centígrados durante dos días.
Después de retirar el medio que contiene las células Schwann lavar los fibroblastos, adhiriéndose a los platos Petri con 1XPBS. Para digerir los fibroblastos, agregue un mililitro de 0.25%trypsin a 37 grados Celsius. Después de la digestión para proceder durante dos minutos a 37 grados Celsius, terminar la digestión mediante la adición de DMEM complementado con 10%FBS.
Para separar los fibroblastos, use una pipeta para soplar en la parte inferior del plato. Recoger el medio, incluidos los fibroblastos, y transferirlo a tubos de centrífuga. Centrifugar los tubos a 800 veces G durante cinco minutos.
Deseche el sobrenadante y resuspendir el precipitado con dos mililitros de DMEM que contienen 10%FBS. Inocule las células en platos Petri sin codificar de 60 milímetros e incubar a 37 grados centígrados durante 30 a 45 minutos. Aislar los fibroblastos que se adhieren a los platos Petri, retirando y descartando el medio de crecimiento.
Añadir tres mililitros de DMEM complementados con 10%FBS. Incubar a 37 grados centígrados durante dos días hasta que el paso una célula alcance el 90% de confluencia. Repita la digestión diferencial y la adherencia.
Después de cultivar el paso a fibroblastos y células Schwann durante dos días, digiere las células, recógelas y contadlas. Inocular PLL deslizas recubiertos a una concentración de una por 10 de estas células por pozo para la tinción ICC. La microscopía de contraste de Bay muestra la morfología de células y fibroblastos Schwann cultivados durante todo el proceso de aislamiento.
Después de un tiempo de cultivo prolongado, las células Schwann se agruparon entre los fibroblastos o se localizaron en la superficie de los fibroblastos. Después de la digestión durante 10 segundos, las células Schwann, indicadas por las flechas rojas, eran redondas mientras que los fibroblastos permanecieron planos y estaban unidos a la parte inferior del plato. Después del aislamiento por digestión diferencial y adherencia diferencial se observaron morfologías celulares típicas para los cuatro tipos de células.
Fibroblastos motores, fibroblastos sensoriales, células Schwann motoras y células Sensoriales Schwann. Los fibroblastos sensoriales y motores se visualizaron mediante un microscopio de escaneo láser focal de cono. Los fibroblastos se teñiron con anticuerpos contra el tinte CD 90 X3342 para etiquetar los núcleos celulares.
Las imágenes combinadas de inmunomanchas de fibroblastos y tinción nuclear indicaban que el 92,51% y el 92,64% de las células con etiqueta de CD 90 y hexadas estaban presentes en los fibroblastos motores y sensoriales respectivamente. Las células Schwann sensoriales y motoras se visualizaron utilizando un microscopio de escaneo láser confocal. Las células Schwann se teñiron con anticuerpos contra el tinte S100 X33342 para etiquetar los núcleos celulares.
Las imágenes de fusión de inmunostaining de células Swan y tinción nuclear indicaron la presencia de 91,61% y 93,56% de S100 y células copulares hexagonales en células Schwann motoras y sensoriales, respectivamente. La pureza celular también se analizó utilizando la citometría de flujo. En los cultivos de fibroblastos, aproximadamente el 90% de las células eran fibroblastos, indicados por M2 en los gráficos de FCA, mientras que las células restantes eran células Schwann.
En los cultivos celulares de Schwann, más del 92% de las células eran células Schwann, indicadas de nuevo por M2 en los gráficos de FCA, mientras que las células restantes eran fibroblastos. Este protocolo rara vez es útil para iniciar el mecanismo de regeneración del sensor y del nervio motor de los fibroblastos, y el trasplante de células Schwann, para promover la regeneración nerviosa.
