Questo protocollo può essere utilizzato per ottenere un gran numero di sensori e le cellule fibroblasto motore e Schwann rapidamente. Le cellule ottenute attraverso questo messaggio possono essere utilizzate nello studio della rigenerazione nervosa e delle malattie del sistema nervoso. Mostriamo che la dimostrazione può rappresentare lo sperimentale per controllare meglio il tempo del passo digestivo differenziale e rendere i passaggi sperimentali più facili da capire.
Per scoppiare utilizzare le forbici per fare un'incisione di tre centimetri, nella pelle della schiena. Rimuovere la colonna vertebrale. Aprire con cura il canale vertebrale per esporre il midollo spinale.
Allagare il midollo spinale in una piastra di Petri di 60 millimetri, con da tre a quattro millilitri di soluzione salina bilanciata D Hanks ghiacciata al microscopio sezionato, asportare la radice ventrale e la radice dorsale. Mettili nella soluzione salina bilanciata D Hanks ghiacciata. Dopo aver rimosso l'HBSS, tagliare i nervi in pezzi da tre a cinque millimetri, con le forbici.
Aggiungere un millilitro dello 0,25% di tripside e trasferire i pezzi nervosi in cinque tubi di centrifuga millilitro. Incubare a 37 gradi Celsius per 18-20 minuti. Successivamente, per interrompere la digestione, aggiungere da tre a quattro millilitri di DMEM contenenti il 10% di siero bovino fetale.
Pipettare delicatamente la miscela su e giù circa 10 volte. Centrifuga a 800 volte G per cinque minuti. Dopo la centrifugazione scartare il supernatante.
E sospendere nuovamente il precipitato in due o tre millilitri di DMEM integrati con 10%FBS. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro a rete da 400, quindi utilizzare la sospensione per inoculare una piastra di Petri di 60 millimetri. Incubare le piastre di Petri per quattro o cinque giorni a 37 gradi Celsius, in presenza del 5% di anidride carbonica.
Quando le impostazioni cultura hanno raggiunto il 90% di confluenza, lavare le celle una volta utilizzando 1XPBS. Quindi, per digerire le cellule di Schwann, aggiungere un millilitro dello 0,25% di tripside a 37 gradi Celsius per piatto da 60 millimetri. Dopo otto-10 secondi a temperatura ambiente, interrompere la digestione, aggiungendo tre millilitri di DMEM integrati con 10%FBS.
Per staccare le cellule di Schwann, soffiare delicatamente sulla cella con una pipetta. Verificare al microscopio che le celle siano scollegate. Quindi raccogliere il mezzo, che contiene le cellule del cigno, e centrifugare a 800 volte G per cinque minuti.
Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il precipitato in tre millilitri di mezzo. Utilizzare questa sospensione per inoculare piatti petri non patinato da 60 millimetri e incubare i piatti a 37 gradi Celsius per 30-45 minuti. Marchi per il mezzo, che conterrà le cellule di Schwann a un piatto medio rivestito di lisina Poly L e incubare il piatto a 37 gradi Celsius per due giorni.
Dopo aver rimosso il mezzo contenente le cellule di Schwann lavare i fibroblasti, aderendo alle piastre di Petri con 1XPBS. Per digerire i fibroblasti, aggiungere un millilitro dello 0,25% di tripparina a 37 gradi Celsius. Dopo aver seguito la digestione per procedere per due minuti a 37 gradi Celsius, terminare la digestione aggiungendo DMEM integrato con 10%FBS.
Per staccare i fibroblasti, utilizzare una pipetta per soffiare sul fondo del piatto. Raccogliere il mezzo, compresi i fibroblasti, e trasferirlo in tubi di centrifuga. Centrifugare i tubi a 800 volte G per cinque minuti.
Scartare il supernatante e rimescolare il precipitato con due millilitri di DMEM contenenti il 10%FBS. Inoculare le cellule in piatti di Petri non codificati da 60 millimetri e incubare a 37 gradi Celsius per 30-45 minuti. Isolare i fibroblasti che aderirono alle piastre di Petri, rimuovendo e scartando il mezzo di crescita.
Aggiungere tre millilitri di DMEM integrati con 10%FBS. Incubare a 37 gradi Celsius per due giorni fino a quando il passaggio di una o più cellule raggiunge il 90% di confluenza. Ripetere la digestione differenziale e l'aderenza.
Dopo aver coltivato il passaggio ai fibroblasti e alle cellule di Schwann per due giorni, digerire le cellule, raccoglierle e contarle. Inoculare i vetri rivestiti in PLL ad una concentrazione di una volta 10 di queste cellule per pozzo per la colorazione ICC. La microscopia a contrasto di Bay mostra la morfologia delle cellule di Schwann coltivate e dei fibroblasti durante tutto il processo di isolamento.
Dopo un prolungato periodo di coltura, le cellule di Schwann furono raggruppate tra i fibroblasti o situate sulla superficie dei fibroblasti. Dopo la digestione per 10 secondi, le cellule di Schwann, indicate dalle frecce rosse, erano rotonde mentre i fibroblasti rimanevano piatti e venivano attaccati al fondo del piatto. Dopo l'isolamento per digestione differenziale e aderenza differenziale sono state osservate morfologie cellulari tipiche per tutti e quattro i tipi di cellule.
Fibroblasti motori, fibroblasti sensoriali, cellule motorie di Schwann e cellule sensoriali di Schwann. I fibroblasti sensoriali e motori sono stati visualizzati utilizzando un microscopio a scansione laser focale a cono. I fibroblasti erano macchiati di anticorpi contro il colorante CD 90 X33342 per etichettare i nuclei cellulari.
Le immagini fuse dell'immunostaining dei fibroblasti e della colorazione nucleare indicavano che il 92,51% e il 92,64% del CD 90 e delle cellule coetichetiche esagonali erano presenti rispettivamente nei fibroblasti motori e sensoriali. Le celle Schwann sensoriali e motorie sono state visualizzate utilizzando un microscopio a scansione laser confocale. Le cellule di Schwann erano macchiate di anticorpi contro il colorante S100 X33342 per etichettare i nuclei cellulari.
Le immagini di fusione dell'immunostaining delle cellule swan e della colorazione nucleare hanno indicato la presenza rispettivamente del 91,61% e del 93,56% dell'S100 e delle cellule coetichetta esagonali nelle cellule di Schwann motorie e sensoriali. La purezza cellulare è stata anche analizzata usando la citometria del flusso. Nelle colture di fibroblasti, circa il 90% delle cellule erano fibroblasti, indicati da M2 nei grafici FCA mentre le restanti cellule erano cellule di Schwann.
Nelle colture cellulari di Schwann, più del 92% delle cellule erano cellule di Schwann, sempre indicate da M2 nei grafici FCA, mentre le cellule rimanenti erano fibroblasti. Questo protocollo è raramente utile per avviare il meccanismo di rigenerazione del sensore e del nervo motorio dei fibroblasti e il trapianto di cellule di Schwann, per promuovere la rigenerazione nervosa.
