このプロトコルは、多数のセンサーと、モータ線維芽細胞およびシュワン細胞を迅速に得るために使用することができる。このメッセージを通して得られた細胞は、神経再生および神経系疾患の研究に使用することができる。我々は、微分消化ステップの時間をより良く制御し、実験ステップを理解しやすくする実験を表すことができる実証を示す。
背中の皮膚に3センチの切開を行うためにはさみをバーストする。脊柱を取り外します。脊髄を露出させるために椎管を慎重に開きます。
60ミリメートルのペトリ皿で脊髄をレースし、3〜4ミリリットルの氷冷Dハンクスバランス塩溶液を解剖顕微鏡の下でバランスよく、腹側根と側側根を切除する。氷冷Dハンクスバランス塩溶液にそれらを置きます。HBSSを取り外した後、神経をハサミで3~5ミリメートルにスライスします。
0.25%トリプシンの1ミリリットルを追加し、5ミリリットル遠心管に神経片を移します。摂氏37度で18~20分インキュベートします。次に、消化を停止するには、10%のウシ胎児血清を含むDMEMの3〜4ミリリットルで追加する。
混合物を上下に約10回ピペットします。800倍Gで5分間遠心分離機。遠心後上清を捨てる。
そして、10%FBSを補充したDMEMの2〜3ミリリットルで沈殿物を再中断する。400メッシュフィルターを通して細胞懸濁液を濾過し、その後、60ミリメートルペトリ皿を接種するために懸濁液を使用します。5%の二酸化炭素の存在下で、摂氏37度で4〜5日間ペトリ料理をインキュベートします。
培養が90%合流した場合は、1XPBSを使用して細胞を1回洗浄します。次に、シュワン細胞を消化し、60ミリメートル皿あたり37°Cで0.25%トリプシンの1ミリリットルを加えます。室温で8〜10秒後、消化を停止し、10%FBSを添加したDMEMの3ミリリットルを添加する。
シュワン細胞を取り外すには、ピペットで細胞を軽く吹きます。細胞が剥離していることを顕微鏡で確認します。その後、白鳥の細胞を含む培地を収集し、遠心分離機を800倍Gで5分間回収する。
上清を捨て、沈殿物を3ミリリットルの培地で再懸濁する。この懸濁液を使用して、コーティングされていない60ミリメートルのペトリ料理を接種し、30〜45分間摂氏37度で調理します。ポリLリジンコーティングされたミディアムディッシュにシュワン細胞を含み、2日間摂氏37度でインキュベートする培地のブランド。
シュワン細胞を含む培地を除去した後、線維芽細胞を洗浄し、1XPBSでペトリ皿に付着する。線維芽細胞を消化するには、摂氏37度で0.25%トリプシンの1ミリリットルを加えます。37°Cで2分間進行する消化に続いた後、10%FBSを添加したDMEMを加えることによって消化を終了します。
線維芽細胞を取り外すには、ピペットを使用して皿の底を吹きます。線維芽細胞を含む培地を収集し、遠心分離管に移します。チューブを800倍Gで5分間遠心分離する。
上清を捨て、10%FBSを含むDMEMの2ミリリットルで沈殿を再懸濁する。コード化されていない60ミリメートル、ペトリ皿で細胞を接種し、30〜45分間摂氏37度でインキュベートします。ペトリ皿に付着する線維芽細胞を分離し、成長培地を除去および廃棄する。
10%FBSで補ったDMEMの3ミリリットルを追加します。1つの細胞が90%合流に達するまで2日間摂氏37度でインキュベートする。分差消化と付着を繰り返します。
線維芽細胞とシュワン細胞への通路を2日間培養した後、細胞を消化し、それらを収集し、それらを数えます。ICC染色のために、これらの細胞の1倍の濃度でPLLコーティングスライドを接種します。ベイの対比顕微鏡は、分離過程を通じて培養シュワン細胞および線維芽細胞の形態を示す。
培養時間を長くした後、シュワン細胞を線維芽細胞の間に集結させたか、または線維芽細胞の表面に位置した。10秒間消化した後、赤い矢印で示されたシュワン細胞は丸く、線維芽細胞は平らなままで、皿の底に取り付けられました。分離による分離消化および微分付着による分離後、典型的な細胞形態は4種類すべてについて観察された。
運動線維芽細胞、感覚線維芽細胞、モーターシュワン細胞および感覚シュワン細胞。感覚および運動線維芽細胞を、コーンフォーカルレーザー走査顕微鏡を用いて可視化した。線維芽細胞をCD 90 X33342色素に対する抗体で染色し、細胞核を標識するために使用した。
免疫染色と核染色の線維芽細胞の合成画像は、CD90およびヘックス共標識された細胞の92.51%および92.64%が、それぞれ運動および感覚線維芽細胞に存在していたことを示した。感覚およびモーターシュワン細胞を共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて可視化した。シュワン細胞をS100 X33342色素に対する抗体で染色し、細胞核に標識するために使用した。
スワン細胞免疫染色と核染色の合成画像は、それぞれ、S100およびヘックス共標識された細胞の91.61%および93.56%の存在を示した。細胞純度もフローサイトメトリーを用いて分析した。線維芽細胞培養では、約90%の細胞が線維芽細胞であり、残りの細胞がシュワン細胞であった間FCAグラフでM2によって示された。
シュワン細胞培養では、92%以上の細胞がシュワン細胞であり、FCAグラフではM2によって再び示され、残りの細胞は線維芽細胞であった。このプロトコルは、線維芽細胞のセンサーおよび運動神経再生のメカニズムを開始し、シュワン細胞移植を開始し、神経再生を促進するのにはほとんど有用ではない。
