Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine große Anzahl von Sensor- und Motor-Fibroblasten und Schwann-Zellen schnell zu erhalten. Die durch diese Botschaft erhaltenen Zellen können bei der Untersuchung der Nervenregeneration und Erkrankungen des Nervensystems verwendet werden. Wir zeigen, dass Demonstration das Experimentelle darstellen kann, um die Zeit des differenziellen Verdauungsschritts besser zu kontrollieren und die experimentellen Schritte leichter zu verstehen.
Zum Bersten verwenden Sie eine Schere, um einen drei Zentimeter großen Schnitt in der Haut des Rückens zu machen. Entfernen Sie die Wirbelsäule. Öffnen Sie den Wirbelkanal vorsichtig, um das Rückenmark freizulegen.
Schnüren Sie das Rückenmark in einer 60-Millimeter-Petrischale, mit drei bis vier Millilitere eiskalte D Hanks ausgewogene Salzlösung unter einem Sezieren Mikroskop, Verbrauch der ventralen Wurzel und der rückenden Wurzel. Legen Sie sie in eiskalte D Hanks ausgewogene Salzlösung. Nach dem Entfernen der HBSS die Nerven mit einer Schere in drei bis fünf Millimeter schneiden.
Fügen Sie einen Milliliter 0,25%Trypsin hinzu und übertragen Sie die Nervenstücke in fünf Milliliter Zentrifugenröhren. Bei 37 Grad Celsius für 18 bis 20 Minuten inkubieren. Als nächstes, um die Verdauung zu stoppen, fügen Sie bei drei bis vier Milliliter DMEM enthält 10%fetales Rinderserum.
Pipette die Mischung auf und ab sanft etwa 10 Mal. Zentrifuge bei 800 mal G für fünf Minuten. Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen.
Und den Niederschlag in zwei bis drei Milliliter DMEM, ergänzt mit 10%FBS, wieder aussetzen. Filtern Sie die Zellsuspension durch einen 400-Mesh-Filter, und verwenden Sie dann die Suspension, um eine 60-Millimeter-Petrischale zu impfen. Inkubieren Sie die Petrischalen für vier bis fünf Tage bei 37 Grad Celsius, in Gegenwart von 5% Kohlendioxid.
Wenn die Kultur 90% Zusammenfluss erreicht hat, waschen Sie die Zellen einmal mit 1XPBS. Um dann die Schwann-Zellen zu verdauen, fügen Sie einen Milliliter 0,25% Trypsin bei 37 Grad Celsius pro 60-Millimeter-Schale hinzu. Nach acht bis zehn Sekunden bei Raumtemperatur, stoppen Sie die Verdauung, indem Sie drei Milliliter DMEM mit 10%FBS ergänzt.
Um die Schwann-Zellen zu lösen, blasen Sie die Zelle vorsichtig mit einer Pipette. Überprüfen Sie mit dem Mikroskop, ob die Zellen getrennt sind. Dann sammeln Sie das Medium, das die Schwanenzellen enthält, und Zentrifuge bei 800 mal G für fünf Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie den Niederschlag in drei Milliliter Medium wieder aus. Verwenden Sie diese Suspension, um unbeschichtete 60-Millimeter-Petri-Gerichte zu impfen und die Gerichte 30 bis 45 Minuten bei 37 Grad Celsius zu bebrüten. Marken für das Medium, das die Schwann-Zellen zu einer Poly L Lysin beschichteten Mittelschale enthalten wird, und bebrüten die Schale bei 37 Grad Celsius für zwei Tage.
Nach dem Entfernen des Mediums, das die Schwann-Zellen enthält, waschen Sie die Fibroblasten und halten sich mit 1XPBS an die Petrischalen. Um die Fibroblasten zu verdauen, fügen Sie einen Milliliter 0,25% Trypsin bei 37 Grad Celsius hinzu. Nach der anschließenden Verdauung für zwei Minuten bei 37 Grad Celsius, beenden Sie die Verdauung durch Zugabe von DMEM ergänzt mit 10%FBS.
Um die Fibroblasten zu lösen, verwenden Sie eine Pipette, um auf den Boden der Schale zu blasen. Sammeln Sie das Medium, einschließlich der Fibroblasten, und übertragen Sie es in Zentrifugenrohre. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 800 mal G für fünf Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand, und setzen Sie den Niederschlag mit zwei MilliliterDMEM, die 10%FBS enthalten, wieder auf. Impfen Sie die Zellen in uncodierten, 60 Millimeter, Petrischalen, und brüten Sie bei 37 Grad Celsius für 30 bis 45 Minuten. Isolieren Sie die Fibroblasten, die an den Petrischalen haften, indem Sie das Wachstumsmedium entfernen und entsorgen.
Fügen Sie drei Milliliter DMEM hinzu, ergänzt durch 10%FBS. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für zwei Tage, bis die Durchgangszellen 90% Zusammenfluss erreichen. Wiederholen Sie die Differentialverdauung und -haftung.
Nachdem Sie den Durchgang zu Fibroblasten und Schwann-Zellen für zwei Tage kultiviert haben, verdauen Sie die Zellen, sammeln Sie sie und zählen sie. PLL-beschichtete Dias mit einer Konzentration von einem mal 10 dieser Zellen pro Brunnen für die ICC-Färbung impfen. Bays Kontrastmikroskopie zeigt die Morphologie kultivierter Schwann-Zellen und Fibroblasten während des gesamten Isolationsprozesses.
Nach längerer Kulturzeit wurden die Schwann-Zellen zwischen den Fibroblasten zusammengeballt oder auf der Oberfläche von Fibroblasten lokalisiert. Nach der Verdauung für 10 Sekunden waren die Schwann-Zellen, die durch die roten Pfeile angezeigt wurden, rund, während die Fibroblasten flach blieben und an der Unterseite der Schale befestigt waren. Nach der Isolierung durch Differentialverdauung und Differentialhaftung wurden für alle vier Zelltypen typische Zellmorphologien beobachtet.
Motorische Fibroblasten, sensorische Fibroblasten, motorische Schwannzellen und sensorische Schwannzellen. Die sensorischen und motorischen Fibroblasten wurden mit einem Kegelfokus-Laserscanmikroskop visualisiert. Die Fibroblasten wurden mit Antikörpern gegen CD 90 X33342 Farbstoff gefärbt wurde verwendet, um die Zellkerne zu beschriften.
Die zusammengeführten Bilder von Fibroblasten Immunfärbung und Kernfärbung, zeigten, dass 92,51% und 92,64% der CD 90 und hexed co-labeled Zellen, waren in den motorischen und sensorischen Fibroblasten jeweils vorhanden. Die sensorischen und motorischen Schwann-Zellen wurden mit einem konfokalen Laserscanmikroskop visualisiert. Die Schwann-Zellen wurden mit Antikörpern gegen S100 X33342 Farbstoff gefärbt, um die Zellkerne zu beschriften.
Die Verschmelzungsbilder von Schwanenzell-Immunostainierung und nuklearer Färbung deuteten auf 91,61% bzw. 93,56% der S100 und mitbeschrifteten ko-markierten Zellen in motorischen bzw. sensorischen Schwann-Zellen hin. Die Zellreinheit wurde auch mit Hilfe der Durchflusszytometrie analysiert. In den Fibroblastenkulturen waren etwa 90% der Zellen Fibroblasten, die durch M2 in den FCA-Diagrammen angegeben wurden, während die verbleibenden Zellen Schwann-Zellen waren.
In den Schwann-Zellkulturen waren mehr als 92% der Zellen Schwann-Zellen, die wiederum durch M2 in den FCA-Diagrammen angegeben wurden, während die verbleibenden Zellen Fibroblasten waren. Dieses Protokoll ist selten nützlich, um den Mechanismus der Sensor- und Motornervenregeneration von Fibroblasten und die Schwann-Zelltransplantation zu starten, um die Nervenregeneration zu fördern.
