Этот протокол может быть использован для получения большого количества датчиков и двигательных фибробластов и клеток Шванн быстро. Клетки, полученные через это сообщение могут быть использованы в изучении регенерации нервов и заболеваний нервной системы. Мы показываем, демонстрация может представлять экспериментальные лучше контролировать время дифференциала пищеварительной шаг и сделать экспериментальные шаги легче понять.
Чтобы лопнуть использовать ножницы, чтобы сделать три сантиметра разреза, в коже спины. Удалите позвоночник. Тщательно откройте позвоночный канал, чтобы разоблачить спинной мозг.
Зашнуйте спинной мозг в 60-миллиметровой чашке Петри, с тремя-четырьмя миллилитров ледяного D Хэнкса сбалансированный раствор соли под рассекающий микроскоп, акциз брюшного корня и спинного корня. Поместите их в ледяной D Хэнкс сбалансированный раствор соли. После удаления HBSS, нарезать нервы на три-пять миллиметров штук, с ножницами.
Добавьте один миллилитр 0,25%трипсина и перенесите нервные кусочки в пять миллилитровых центрифугных трубок. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 18 до 20 минут. Затем, чтобы остановить пищеварение, добавьте в три-четыре миллилитров DMEM, содержащих 10%фетальной сыворотки крупного рогатого скота.
Pipette смесь вверх и вниз мягко около 10 раз. Центрифуга при 800 раз G в течение пяти минут. После центрифугации откажитесь от супернатанта.
И повторно приостановить осадок в два-три миллилитров DMEM дополнены 10%FBS. Фильтровать подвеску клетки через 400-сетчатый фильтр, а затем использовать подвеску, чтобы привить 60-миллиметровую чашку Петри. Инкубировать чашки Петри в течение четырех-пяти дней при 37 градусах по Цельсию, при наличии 5%углекислого газа.
Когда культура достигла 90% слияния, мыть клетки один раз с помощью 1XPBS. Затем, чтобы переварить клетки Шванн, добавьте один миллилитр 0,25%трипсина при 37 градусах цельсия на 60-миллиметровую тарелку. После 8 до 10 секунд при комнатной температуре, остановить пищеварение, добавив три миллилитров DMEM дополняется 10%FBS.
Чтобы отсоединить клетки Шванн, осторожно удар по клетке с пипеткой. Убедитесь с помощью микроскопа, что клетки отделены. Затем соберите среду, которая содержит лебединые клетки, и центрифугу в 800 раз G в течение пяти минут.
Отбросьте супернатант и повторно приостановьте осадок в трех миллилитров среднего. Используйте эту подвеску, чтобы привить неокрашенные 60 миллиметровые блюда Петри, и инкубировать блюда при 37 градусах по Цельсию в течение 30 до 45 минут. Бренды для среды, которая будет содержать клетки Шванн в Полисин Поли L покрытием среднего блюда, и инкубировать блюдо при 37 градусов по Цельсию в течение двух дней.
После удаления среды, содержащей клетки Шванн мыть фибробласты, придерживаясь чашки Петри с 1XPBS. Чтобы переварить фибробласты, добавьте один миллилитр 0,25%трипсина при 37 градусах Цельсия. После после пищеварения, чтобы продолжить в течение двух минут при 37 градусах по Цельсию, конец пищеварения, добавив DMEM дополняется 10%FBS.
Чтобы отсоединить фибробласты, используйте пипетки, чтобы взорвать на дне блюда. Соберите носитель, включая фибробласты, и перенесите его в центрифуги труб. Центрифуга труб при 800 раз G в течение пяти минут.
Отбросьте супернатант и повторно посовелите осадок двумя миллилитровми DMEM, содержащими 10%FBS. Прививки клеток в некодируемых, 60 миллиметров, Петри блюда, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 30 до 45 минут. Изолировать фибробласты, которые будут придерживаться чашки Петри, путем удаления и отбрасывания среды роста.
Добавьте три миллилитров DMEM, дополненных 10%FBS. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение двух дней, пока прохождение одной клетки не достигнет 90% слияния. Повторите дифференциальное пищеварение и присоединение.
После культивирования прохода в фибробласты и клетки Шванн в течение двух дней, переварить клетки, собрать их, и считать их. Прививка PLL покрытием слайды при концентрации один раз 10 из этих клеток на колодец для окрашивания МТП. Контрастная микроскопия Бэй показывает морфологию культурных клеток Шванн и фибробластов на протяжении всего процесса изоляции.
После длительного времени культуры, клетки Шванн были сгруппированы между фибробластами или расположены на поверхности фибробластов. После пищеварения в течение 10 секунд, клетки Шванн, указанные красными стрелками, были круглыми, в то время как фибробласты оставались плоскими и были прикреплены к нижней части блюда. После изоляции дифференциальным пищеварением и дифференциальным присоединением наблюдались типичные морфологии клеток для всех четырех типов клеток.
Моторные фибробласты, сенсорные фибробласты, моторные клетки Шванн и сенсорные клетки Шванн. Сенсорные и моторные фибробласты были визуализированы с помощью конусного фокусного лазерного сканирующего микроскопа. Фибробласты были окрашены антителами против CD 90 X33342 краситель был использован для обозначения ядер клеток.
Объединенные изображения фибробластов иммуностеинирования и ядерного окрашивания, показали, что 92,51% и 92,64% CD 90 и шестиугольных ко маркирований клеток, присутствовали в двигательных и сенсорных фибробластов соответственно. Сенсорные и моторные клетки Шванн были визуализированы с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Клетки Шванн были окрашены антителами против S100 X33342 краситель был использован для обозначения ядер клеток.
Слияние изображений иммуностернинга и ядерного окрашивания лебединых клеток показало наличие 91,61% и 93,56% S100 и шестиугольных ко маркированных клеток в двигательных и сенсорных клетках Шванн, соответственно. Чистота клеток также была проанализирована с использованием цитометрии потока. В фибробластных культурах примерно 90% клеток были фибробластами, указанными M2 на графиках FCA, в то время как остальные клетки были клетками Шванн.
В культурах клеток Шванн более 92% клеток были клетками Шванн, опять же указанными M2 на графиках FCA, в то время как остальные клетки были фибробластами. Этот протокол редко бывает полезен для запуска механизма регенерации фибробластов датчика и моторного нерва, а также для трансплантации клеток Шванн для содействия регенерации нервов.
