A regulação espesso estotemporal precisa dos genes é controlada por diversos elementos cis-regulatórios que interagem entre eles. Nosso protocolo permite interrogar quantitativamente contatos de cromatina de loci selecionados, como promotores. Essa técnica nos permite identificar e quantificar as frequências de interação entre vários elementos regulatórios simultaneamente.
Para gerar corpos embrionários, comece por cultivar células-tronco embrionárias de camundongos a 60% de confluência. Em seguida, remova o meio de cultura e lave duas vezes com dois mililitros de PBS esterilizados. Remova completamente o PBS e adicione dois mililitros do meio de descolamento celular.
Incubar o prato de cultura a 37 graus Celsius. Após a incubação por cinco minutos, adicione oito mililitros de meio de diferenciação EB ao prato. Para dissociar as colônias mESC para obter uma suspensão unicelular, pipete o médio para cima e para baixo 15 a 20 vezes, e transfira a suspensão para um tubo de 10 mililitros.
Centrifugar as células a 300 vezes g à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, remova cuidadosamente o supernaspe. Após a contagem das células, resuspense a pelota celular com meio de diferenciação EB.
Inverta a tampa de um prato de cultura de 15 centímetros. Usando uma pipeta multicanal multicanal de 200 microlitos, deposite gotas de 20 microliter de células resuspended na tampa. Inverta a tampa cuidadosamente, e coloque-a na parte inferior do prato de cultura.
Incubar o prato com as gotas penduradas por três dias. Para coletar as células após a incubação, lave a tampa suavemente com 10 mililitros de PBS. Transfira o PBS, que conterá os EBs, para um tubo plástico de 50 mililitros.
Depois de deixar o tubo descansar por 30 minutos à temperatura ambiente, remova cuidadosamente o sobrenante. Os EBs serão deixados na parte inferior do tubo. Resuspenque suavemente os EBs em 10 mililitros de meio de diferenciação EB fresco.
Transfira a suspensão para uma placa de Petri bacteriológica de 10 centímetros. Três a seis dias depois, use um microscópio invertido para verificar a formação do EB. Os EBs devem ser redondos e homogêneos em tamanho.
Colete os EBs de dois ou três pratos de 10 centímetros em um tubo plástico de 50 mililitros. Centrifugar os EBs a 300 vezes g durante cinco minutos em temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o supernasce e resuspense os EBs em 10 mililitros de PBS.
Centrifugar os EBs a 300 vezes g em temperatura ambiente novamente, desta vez por três minutos. Remova o supernatante e adicione dois mililitros de trypsin-EDTA à pelota. Incubar o tubo a 37 graus Celsius por 15 minutos.
Durante a incubação, pipeta para cima e para baixo a cada três minutos para obter uma suspensão de célula única. Para parar a reação de trippsina, adicione oito mililitros de meio de diferenciação EB. Depois de reutilizar as células em meio EB fresco, adicione paraformaldeído a uma concentração final de 1%Incubar as células por 10 minutos em temperatura ambiente em rotação.
Sacie o formaldeído adicionando glicina a uma concentração final de 0,125 molar. Complete o processo de fixação como descrito no manuscrito, e então congele as pelotas celulares em nitrogênio líquido. Levemente resuspenque a pelota de célula em um tampão de lise gelada recém-preparado, e coloque o tubo no gelo.
Após 15 minutos, centrifugar as células a 1.000 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernasciente e lave a pelota com 500 microliters de tampão de lise fria. Resuspenque a pelota em um tubo de 1,5 mililitro com 50 microliters de 0,5% SDS em 1x tampão dois, e coloque o tubo em um bloco de aquecimento a 62 graus Celsius.
Após 10 minutos, retire o tubo do bloco de aquecimento e adicione o tampão de digestão. Misture bem por pipetar, evitando espuma excessiva e incubar o tubo a 37 graus Celsius. Para garantir a eficiente restrição da digestão enzimápica, neste protocolo, incluímos um passo repetitivo de digestão.
É por isso que também é importante resuspensar bem os núcleos no tampão de digestão. Adicione outros 25 microliters de tampão de digestão, misture invertendo e tome oito microliters como um controle não digerido. Armazene a amostra de controle não digerida a 20 graus Celsius negativos.
Em seguida, você adicionará várias alíquotas da enzima de restrição Mbol, incubando a 37 graus Celsius sob rotação após cada alíquota. Tome oito microliters como uma amostra de controle digerida. Para descruzar ambas as amostras de controle, adicione 80 microliters de tampão de TE em 10 microliters de proteinase K.Incubate a 65 graus Celsius por uma hora.
Para verificar a eficiência da digestão, execute alíquotas de 20 microliter em um gel de 0,6%. Digestões bem sucedidas mostram fragmentos principalmente na faixa de pares de 3,0 a 5,0 quilobases. Prepare o DNA para a tesoura, como descrito no manuscrito.
Use um sonicator para cisar o DNA para um tamanho de 150 a 700 pares de base. Transfira o DNA desarquivado para um novo tubo de bloqueio seguro normal, juntando várias sônicas da mesma amostra. Adicione contas de purificação de DNA aquecidas em uma quantidade equivalente a 1,8 vezes o volume existente e misture por resususcupação.
Após cinco minutos de incubação, colete as contas com um rack magnético. Mantendo os tubos no rack magnético, lave as contas duas vezes com um mililitro de etanol recém-preparado 80%. Depois de secar as contas a temperatura ambiente por dois a três minutos, elute o DNA resususpending as contas em 1x Tris buffer.
Utilizando-se o método de queda de suspensão, uma população homogênea de EBs foi obtida seis dias após a indução da diferenciação da ESC. A eletroforese gel foi realizada em todo o protocolo de controle de qualidade. A digestão eficiente por Mbol resulta em fragmentos de menos de três pares de quilobase.
A eletroforese após a ligadura mostrou que a maioria dos fragmentos eram maiores que três pares de quilobase. Tamanhos de fragmentos de 400 a 500 pares de base são esperados após a sônicação. Após a desfosforilação e a ligadura de adaptador de extremidade única, duas rodadas de PCR foram realizadas para amplificar os alvos de interesse.
Cada alvo foi amplificado separadamente com dois pares de primer diferentes, A e B para o lócus Pou5f1 e C e D para o lócus T. Isso resultou em uma mancha de DNA em torno de 400 pares de bases. Alternativamente, o MULTIPLEX PCR foi realizado para amplificar os alvos A e C simultaneamente, resultando em um tamanho de fragmento semelhante após a purificação.
Nestes perfis 4C, as caixas azuis claras indicam a localização dos aprimoramentos com mudanças dinâmicas durante a diferenciação. As regiões de Cromatina entram em contato com os promotores dos genes Pou5f1 e T durante a diferenciação do EB. Pou5f1 foi rebaixado durante a diferenciação da EB.
Por outro lado, t foi regulado durante a diferenciação de EB. A digestão eficiente da enzima de restrição e, em seguida, a ligadura de proximidade do DNA genômico de travessia são fatores-chave para garantir o sucesso deste protocolo. Outra coisa é o projeto primer para interrogar o mapa de contato de cada lócus.
Este procedimento é ideal para interrogar o contato de cromatina em loci alvo. Se forem necessárias mudanças globais, abordagens em todo o genoma, como Hi-C, captura de promotor Hi-C ou HiChIP, podem ser realizadas.
