La régulation spatiotemporale précise des gènes est contrôlée par divers éléments cis-réglementaires qui interagissent entre eux. Notre protocole permet d’interroger quantitativement les contacts chromatineux de certains loci tels que les promoteurs. Cette technique nous permet d’identifier et de quantifier simultanément les fréquences d’interaction entre les différents éléments réglementaires.
Pour générer des corps embryoïdes, commencez par la culture des cellules souches embryonnaires de souris à 60% de confluence. Retirez ensuite le milieu de culture et lavez-le deux fois avec deux millilitres de PBS stérilisé. Retirez complètement le PBS et ajoutez deux millilitres de milieu de détachement cellulaire.
Incuber le plat de culture à 37 degrés Celsius. Après l’incubation pendant cinq minutes, ajouter huit millilitres de milieu de différenciation EB au plat. Pour dissocier les colonies du MESC pour obtenir une suspension à cellule unique, pipette le milieu de haut en bas 15 à 20 fois, et transférer la suspension dans un tube de 10 millilitres.
Centrifuger les cellules à 300 fois g à température ambiante pendant cinq minutes. Retirez ensuite soigneusement le surnatant. Après avoir compté les cellules, résuspendez la pastille cellulaire avec le milieu de différenciation EB.
Inverser le couvercle d’un plat de culture de 15 centimètres. À l’aide d’une pipette multicanal de 200 microlitres, déposer des gouttes de 20 microlitres de cellules résuspendues sur le couvercle. Inversez soigneusement le couvercle et placez-le sur la partie inférieure du plat de culture.
Incuber le plat avec les gouttes suspendues pendant trois jours. Pour recueillir les cellules après l’incubation, lavez doucement le couvercle avec 10 millilitres de PBS. Transférez le PBS, qui contiendra les EBs, dans un tube en plastique de 50 millilitres.
Après avoir laissé reposer le tube pendant 30 minutes à température ambiante, retirez soigneusement le surnatant. Les ER seront laissés au bas du tube. Resuspendez doucement les ER en 10 millilitres de milieu de différenciation EB frais.
Transférer la suspension dans une boîte de Pétri bactériologique de 10 centimètres. Trois à six jours plus tard, utilisez un microscope inversé pour vérifier la formation d’EB. Les ER doivent avoir une taille ronde et homogène.
Recueillir les ER de deux ou trois plats de 10 centimètres dans un tube en plastique de 50 millilitres. Centrifuger les ER à 300 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Retirez soigneusement le supernatant et réutilisez les ER en 10 millilitres de PBS.
Centrifugez les EBs à 300 fois g à température ambiante à nouveau, cette fois pendant trois minutes. Retirer le supernatant et ajouter deux millilitres de trypsine-EDTA à la pastille. Incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.
Pendant l’incubation, pipette de haut en bas toutes les trois minutes pour obtenir une suspension à cellule unique. Pour arrêter la réaction de trypsine, ajoutez huit millilitres de milieu de différenciation EB. Après avoir réutilisé les cellules dans le milieu eb frais, ajouter le paraformaldéhyde à une concentration finale de 1% Incuber les cellules pendant 10 minutes à température ambiante sous rotation.
Étancher le formaldéhyde en ajoutant de la glycine à une concentration finale de 0,125 molaire. Terminer le processus de fixation tel que décrit dans le manuscrit, puis casser-congeler les granulés cellulaires dans l’azote liquide. Resuspendez doucement la pastille cellulaire dans un tampon de lyse glacée fraîchement préparé et placez le tube sur la glace.
Après 15 minutes, centrifuger les cellules à 1000 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le supernatant et lavez la pastille avec 500 microlitres de tampon de lyse froide. Resuspendez la pastille dans un tube de 1,5 millilitre avec 50 microlitres de 0,5%SDS en 1x tampon deux, et placez le tube dans un bloc chauffant à 62 degrés Celsius.
Après 10 minutes, retirer le tube du bloc chauffant et ajouter le tampon de digestion. Bien mélanger en pipetage, en évitant la mousse excessive, et incuber le tube à 37 degrés Celsius. Pour assurer une digestion efficace des enzymes de restriction, dans ce protocole, nous avons inclus une étape répétitive de digestion.
C’est pourquoi il est également important de bien résuser les noyaux dans le tampon de digestion. Ajouter 25 autres microlitres de tampon de digestion, mélanger en inversant, et prendre huit microlitres comme un contrôle non digéré. Conservez l’échantillon de contrôle non digéré à un taux négatif de 20 degrés Celsius.
Ensuite, vous ajouterez plusieurs aliquots de l’enzyme de restriction Mbol, incubant à 37 degrés Celsius sous rotation après chaque aliquot. Prenez huit microlitres comme échantillon de contrôle digéré. Pour dissocier les deux échantillons de contrôle, ajoutez 80 microlitres de tampon TE dans 10 microlitres de proteinase K.Incubate à 65 degrés Celsius pendant une heure.
Pour vérifier l’efficacité de la digestion, exécutez des aliquots de 20 microlitres sur un gel de 0,6 %. Les digestions réussies montrent des fragments principalement de l’aire de répartition de 3,0 à 5,0 paires de kilobases. Préparez l’ADN pour le cisaillement tel que décrit dans le manuscrit.
Utilisez un sonicateur pour cisailler l’ADN à une taille de 150 à 700 paires de base. Transférez l’ADN cisaillé dans un nouveau tube de verrouillage sécuritaire normal, mettant en commun plusieurs sonications à partir du même échantillon. Ajouter les perles de purification de l’ADN réchauffées dans une quantité égale à 1,8 fois le volume existant, et mélanger en réutilisant.
Après cinq minutes d’incubation, recueillir les perles à l’avec une grille magnétique. En gardant les tubes dans la grille magnétique, laver les perles deux fois avec un millilitre d’éthanol fraîchement préparé. Après avoir assécher à l’air les perles à température ambiante pendant deux à trois minutes, élitz l’ADN en résustant les perles dans le tampon 1x Tris.
Utilisant la méthode de pendaison-goutte, une population homogène d’EBs a été obtenue six jours après l’induction de la différenciation d’ESC. L’électrophoresis de gel a été exécuté tout au long du protocole pour le contrôle de qualité. Une digestion efficace par Mbol se traduit par des fragments de moins de trois paires kilobase.
L’électrophoresis après ligature a prouvé que la plupart des fragments étaient plus grands que trois paires de kilobase. Des fragments de 400 à 500 paires de base sont attendus après la sonication. Après la déphosphorylation et la ligature de l’adaptateur à extrémité unique, deux séries de PCR ont été effectuées pour amplifier les cibles d’intérêt.
Chaque cible a été amplifiée séparément avec deux paires d’amorce différentes, A et B pour le locus Pou5f1 et C et D pour le locus T. Il en est résulté un frottis d’ADN d’environ 400 paires de base. Alternativement, le PCR multiplex a été exécuté pour amplifier des cibles A et C simultanément, ayant pour résultat une taille semblable de fragment après purification.
Dans ces profils 4C, les boîtes bleu clair indiquent l’emplacement des exhausteurs avec des changements dynamiques lors de la différenciation. Les régions chromatines contactent les promoteurs des gènes Pou5f1 et T lors de la différenciation EB. Pou5f1 a été régulé pendant la différenciation EB.
Inversement, T a été régulée pendant la différenciation eb. La digestion efficace d’enzyme de restriction et puis la ligature de proximité de l’ADN génomique de croisement sont des facteurs clés pour assurer le succès de ce protocole. Une autre chose est la conception de l’amorce pour interroger la carte de contact de chaque lieu.
Cette procédure est idéale pour interroger le contact chromatine sur des loci ciblés. Si des changements mondiaux sont nécessaires, des approches à l’échelle du génome telles que Hi-C, promoteur capture Hi-C, ou HiChIP pourraient être effectuées.
