유전자의 정확한 현절 규칙은 그(것)들 사이 상호 작용하는 각종 시스-규제 요소에 의해 통제됩니다. 우리의 프로토콜은 프로모터와 같은 선택된 loci의 크로마틴 접점을 정량적으로 심문할 수 있게 합니다. 이 기술을 통해 다양한 규제 요소 간의 상호 작용 주파수를 동시에 식별하고 정량화할 수 있습니다.
배아 세포를 생성하려면 마우스 배아 줄기 세포를 60 %의 합류로 배양하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 배양 배지를 제거하고 살균 된 PBS의 2 밀리리터로 두 번 씻습니다. PBS를 완전히 제거하고 세포 분리 배지의 2밀리리터를 추가합니다.
섭씨 37도에서 문화 요리를 배양하십시오. 5 분 동안 인큐베이션 후, 접시에 EB 분화 매체의 8 밀리리터를 추가합니다. 단일 셀 서스펜션을 얻기 위해 mESC 콜로니를 해리시키고, 배지를 위아래로 15~20회 피펫하고, 서스펜션을 10밀리리터 튜브로 이송한다.
실온에서 300배 g의 원심분리기를 5분간 실온에서 분리합니다. 그런 다음 상체를 조심스럽게 제거합니다. 세포를 계산한 후 EB 분화 배지로 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
15센티미터 의 문화 요리뚜껑을 뒤집습니다. 200 마이크로리터 멀티채널 파이펫을 사용하여 뚜껑에 20마이크로리터 방울을 증정합니다. 뚜껑을 조심스럽게 뒤집어 배양 접시의 하단 부분에 놓습니다.
3 일 동안 매달려 방울로 접시를 배양하십시오. 인큐베이션 후 세포를 수집하려면 PBS 10 밀리리터로 뚜껑을 부드럽게 씻으십시오. EB가 포함된 PBS를 50밀리리터 플라스틱 튜브로 옮기습니다.
실내 온도에서 튜브가 30 분 동안 앉게 한 후 상체를 조심스럽게 제거하십시오. EB는 튜브 의 바닥에 남아있을 것입니다. 신선한 EB 분화 매체의 10 밀리리터에서 EB를 부드럽게 재연합니다.
서스펜션을 10센티미터 의 세균성 페트리 접시로 옮는다. 3~6일 후, 반전된 현미경을 사용하여 EB 형성을 확인합니다. EB는 둥글고 균일해야 합니다.
2~3개의 10센티미터 접시에서 50밀리리터 플라스틱 튜브로 EB를 수집합니다. 실온에서 5분 동안 300배 g의 원심분리. 신중하게 상체를 제거하고 PBS의 10 밀리리터에서 EB를 다시 중단합니다.
실온에서 300배 g의 원심분리기를 3분 동안 다시 사용할 수 있습니다. 상체를 제거하고 펠릿에 트립신-EDTA의 2 밀리리터를 추가합니다. 15 분 동안 37 섭씨에서 튜브를 배양.
인큐베이션 동안 파이펫은 3분마다 위아래로 변해 단일 셀 서스펜션을 얻습니다. 트립신 반응을 중지하려면 EB 분화 매체의 8 밀리리터를 추가합니다. 신선한 EB 배지에서 세포를 다시 중단한 후, 파라포름알데히드를 1%의 최종 농도에 넣고 회전 하에서 실온에서 10분 동안 세포를 배양한다.
0.125 어어의 최종 농도에 글리신을 첨가하여 포름알데히드를 담금질한다. 원고에 설명된 대로 고정 과정을 완료한 다음 액체 질소에서 세포 펠릿을 스냅 동결합니다. 갓 준비된 얼음-차가운 용해 버퍼로 셀 펠릿을 부드럽게 재연하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
15 분 후, 원심 분리는 섭씨 4도에서 5 분 동안 1, 000 배 g에서 세포를 원심분리합니다. 상체를 버리고 500 마이크로리터의 차가운 리시스 버퍼로 펠릿을 씻으십시오. 1x 버퍼 2에서 0.5 %의 50 마이크로 리터가있는 1.5 밀리리터 튜브에서 펠릿을 다시 중단하고 튜브를 섭씨 62도의 가열 블록에 놓습니다.
10분 후 가열 블록에서 튜브를 제거하고 소화 버퍼를 추가합니다. 파이펫팅으로 잘 섞어 과도한 발포를 피하고 튜브를 섭씨 37도에서 배양합니다. 효율적인 제한 효소 소화를 보장하기 위해,이 프로토콜에서, 우리는 소화의 반복단계를 포함했다.
그렇기 때문에 소화 완충제에서 핵을 잘 재연하는 것도 중요합니다. 소화 버퍼의 또 다른 25 마이크로 리터를 추가, 반전하여 혼합, 소화되지 않는 컨트롤로 8 마이크로 리터를. 소화되지 않은 제어 샘플을 섭씨 20도에 저장합니다.
다음으로, 제한 효소 Mbol의 여러 알리쿼트를 추가합니다, 각 알리쿼트 후 회전에서 섭씨 37도에서 배양. 소화된 대조군 샘플로 8개의 마이크로리터를 섭취하십시오. 두 제어 샘플을 분리하려면 1시간 동안 섭씨 65도에 단백질Ase K.Incubate 10 마이크로리터에 80마이크로리터의 TE 버퍼를 추가합니다.
소화 효율을 확인하려면 0.6%의 젤로 20마이크로리터 알리코트를 실행합니다. 성공적인 소화는 3.0 ~5.0 킬로베이스 쌍의 범위에서 주로 조각을 보여줍니다. 원고에 설명된 대로 전단에 대한 DNA를 준비한다.
초음파 처리기를 사용하여 DNA를 150 ~ 700 개의 기본 쌍 크기로 전단하십시오. 전단 된 DNA를 일반 새로운 안전 잠금 튜브로 전송하여 동일한 샘플에서 여러 초음파 장치를 풀링합니다. 기존 부피의 1.8배에 해당하는 양으로 따뜻해지는 DNA 정제 구슬을 넣고 재연하여 혼합합니다.
5분 간 인큐베이션을 한 후 마그네틱 랙으로 구슬을 수집합니다. 튜브를 마그네틱 랙에 보관하고, 갓 준비된 80%에탄올 1밀리리터로 구슬을 두 번 씻으십시오. 실온에서 구슬을 2~3분 동안 공기 건조한 후, 1x Tris 버퍼에서 구슬을 재연하여 DNA를 엘테한다.
교수형 드롭 방법을 사용하여, EB의 균질한 인구는 ESC 분화의 유도 후 6 일 얻어졌다. 겔 전기전은 품질 관리를 위한 프로토콜 전반에 걸쳐 수행되었다. Mbol에 의한 효율적인 소화는 3킬로베이스 쌍 미만의 조각을 초래합니다.
결찰 후 전기 포근은 대부분의 파편이 3킬로베이스 쌍보다 큰 것으로 나타났다. 400 ~ 500 개의 기본 쌍의 조각 크기는 초음파 처리 후 예상됩니다. 탈포포릴화 와 단단 어댑터 리칭 후, 관심의 대상을 증폭시키기 위해 두 차례의 PCR 이 수행되었다.
각 표적은 T 궤적에 대한 Pou5f1 궤적 및 C 및 D에 대한 두 개의 서로 다른 프라이머 쌍, A 및 B로 별도로 증폭되었다. 이것은 약 400개의 베이스 쌍의 DNA 얼룩 귀착되었습니다. 대안적으로, 멀티플렉스 PCR은 표적 A와 C를 동시에 증폭시켜 정제 후 유사한 단편 크기를 초래하였다.
이러한 4C 프로파일에서 밝은 파란색 상자는 차별화 중에 동적 변경이 있는 인핸서의 위치를 나타냅니다. 크로마틴 영역은 EB 분화 도중 Pou5f1 및 T 유전자의 프로모터에게 접촉합니다. Pou5f1은 EB 분화 중에 규제를 받았다.
반대로, T는 EB 분화 중에 규제되었습니다. 효율적인 제한 효소 소화 및 교차 게놈 DNA의 근접 결찰은이 프로토콜의 성공을 보장하기 위한 중요한 요소입니다. 또 다른 것은 각 궤적의 접촉맵을 심문하는 프라이머 디자인입니다.
이 절차는 표적 로치에서 크로마틴 접촉을 심문하는 데 이상적입니다. 글로벌 변화가 필요한 경우 Hi-C, 프로모터 포획 Hi-C 또는 HiChIP와 같은 게놈 전체 접근 방식을 수행할 수 있습니다.
