Точная spatiotemporal регуляции генов контролируется различными цис-регуляторных элементов, которые взаимодействуют между ними. Наш протокол позволяет количественно допрашивать хроматин контакты отдельных локусов, таких как промоутеры. Этот метод позволяет одновременно выявлять и количественно определять частоты взаимодействия между различными нормативными элементами.
Для создания эмбриональных тел, начните с культивирования эмбриональных стволовых клеток мыши до 60% слияния. Затем удалить культуру среды, и мыть дважды с двумя миллилитров стерилизованных PBS. Удалите PBS полностью, и добавить два миллилитров ячейки отслоения среды.
Инкубировать блюдо культуры при 37 градусах по Цельсию. После инкубации в течение пяти минут, добавить восемь миллилитров EB дифференциации среды к блюду. Чтобы разобщить колонии mESC, чтобы получить одноклеточную подвеску, пипетка среды вверх и вниз от 15 до 20 раз, и передать подвеску в 10-миллилитровую трубку.
Центрифуга клетки при 300 раз г при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем аккуратно удалите супернатант. После подсчета клеток, повторное течение клеточной гранулы с EB дифференциации среды.
Инвертировать крышку 15-сантиметрового блюда культуры. Используя 200-микролитровую многоканаллеровую пипетку, на хранение 20-микролитровых капель хепонизированных клеток на крышке. Тщательно переверните крышку и поместите ее на нижнюю часть культурного блюда.
Инкубировать блюдо с висячими каплями в течение трех дней. Чтобы собрать клетки после инкубации, аккуратно промойте крышку 10 миллилитров PBS. Перенесите PBS, который будет содержать EBs, к 50-миллилитровой пластиковой трубке.
После сдачи трубки сидеть в течение 30 минут при комнатной температуре, тщательно удалить супернатант. EB будут оставлены в нижней части трубки. Аккуратно повторно посовестите EB в 10 миллилитров свежей среды дифференциации EB.
Перенесите суспензию на 10-сантиметровую бактериологическую чашку Петри. Три-шесть дней спустя, использовать перевернутый микроскоп, чтобы проверить образование EB. EB должны быть круглыми и однородными по размеру.
Соберите EBs из двух или трех 10-сантиметровых блюд в 50-миллилитровую пластиковую трубку. Центрифуга EBs при 300 раз g в течение пяти минут при комнатной температуре. Аккуратно удалите супернатант и повторно посовелите EB в 10 миллилитров PBS.
Центрифуга EBs при 300 раз g при комнатной температуре снова, на этот раз в течение трех минут. Удалите супернатант и добавьте в гранулы два миллилитров трипсина-ЭДТА. Инкубировать трубку при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут.
Во время инкубации, пипетка вверх и вниз каждые три минуты, чтобы получить одноклеточную подвеску. Чтобы остановить реакцию трипсина, добавьте восемь миллилитров среды дифференциации EB. После повторного перерасхода клеток в свежей среде EB, добавить параформальдегид к окончательной концентрации 1%Инкубировать клетки в течение 10 минут при комнатной температуре при вращении.
Утолить формальдегид, добавив глицин в окончательную концентрацию 0,125 молара. Завершите процесс фиксации, как описано в рукописи, а затем заморозить клеточные гранулы в жидком азоте. Аккуратно повторно посовеская клеточные гранулы в свежеприготовленный ледяной лиз буфер, и поместите трубку на лед.
Через 15 минут центрифуга клетки по 1000 раз г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта и вымойте гранулы 500 микролитров холодного буфера лиза. Повторное производство гранул в 1,5-миллилитровой трубке с 50 микролитров 0,5%SDS в 1x буфер два, и поместите трубку в нагревательный блок на 62 градусов по Цельсию.
Через 10 минут снимите трубку с нагревательного блока и добавьте буфер пищеварения. Хорошо перемешать путем трубопроводов, избегая чрезмерного вспенивания, и инкубировать трубку при 37 градусах по Цельсию. Для обеспечения эффективного ограничения пищеварения ферментов, в этом протоколе, мы включили повторяющийся шаг пищеварения.
Вот почему также важно хорошо использовать ядра в буфере пищеварения. Добавьте еще 25 микролитров буфера пищеварения, смешайте путем инвертирования и примите восемь микролитров в качестве непереваренного контроля. Храните непереваренный контрольный образец при отрицательных 20 градусах по Цельсию.
Далее, вы добавите несколько aliquots ограничения фермента Mbol, инкубации при 37 градусов по Цельсию под вращением после каждого aliquot. Возьмите восемь микролитров в качестве переваренного образца управления. Чтобы декрестить оба контрольных образца, добавьте 80 микролитров буфера TE в 10 микролитров протеиназы K.Incubate при 65 градусах по Цельсию в течение одного часа.
Чтобы проверить эффективность пищеварения, запустите 20-микролитровые алициты на 0,6% геля. Успешные пищеварения показывают фрагменты в основном в диапазоне от 3,0 до 5,0 килобазы пар. Подготовь ДНК для стрижки, как описано в рукописи.
Используйте соникатор, чтобы спарить ДНК размером от 150 до 700 базовых пар. Перенесите срублированную ДНК в обычную новую безопасную трубку, объединяют несколько звуковых данных из одного и того же образца. Добавьте разогретые бусы для очистки ДНК в количестве, равном в 1,8 раза существующему объему, и перемешайте путем повторного перерасхода.
После пяти минут инкубации, собирать бисер с магнитной стойкой. Держа трубки в магнитной стойке, мыть бисер два раза с одним миллилитр свежеприготовленных 80% этанола. После высыхания воздуха бисер при комнатной температуре в течение двух-трех минут, elute ДНК путем повторного перерасхода бисера в 1x Tris буфера.
Используя метод подвесного падения, однородная популяция ЭБ была получена через шесть дней после индукции дифференциации ESC. Гель-электрофорез выполнялся на протяжении всего протокола контроля качества. Эффективное пищеварение Mbol приводит к фрагментам менее трех пар килобазы.
Электрофорез после перевязки показал, что большинство фрагментов были больше, чем три пары килобазы. Фрагмент размеров от 400 до 500 базовых пар, как ожидается, после sonication. После дефофорилирования и однокурсной перевязки адаптера, два раунда ПЦР были выполнены для усиления целей, представляющих интерес.
Каждая цель была усилена отдельно двумя различными парами грунтовок, A и B для локуса Pou5f1 и C и D для локуса T. Это привело к мазка ДНК около 400 базовых пар. Кроме того, мультиплекс ПЦР был выполнен для одновременного усиления целей A и C, что привело к аналогичному размеру фрагмента после очистки.
В этих профилях 4C светло-голубые коробки указывают расположение усилителей с динамическими изменениями во время дифференциации. Хроматин регионы контакт промоутеров Pou5f1 и T генов во время дифференциации EB. Pou5f1 был downregulated во время дифференциации EB.
И наоборот, T был upregulated во время дифференциации EB. Эффективное ограничение пищеварения ферментов, а затем близость перевязки пересечения геномной ДНК являются ключевыми факторами для обеспечения успеха этого протокола. Другое дело, грунтовка дизайн для допроса контактной карты каждого локуса.
Эта процедура идеально подходит для допроса хроматина контакт на целевых локусов. Если потребуются глобальные изменения, могут быть выполнены такие подходы, как Hi-C, промоутер Hi-C или HiChIP.
