הרגולציה המרחבית המדויקת של הגנים נשלטת על ידי אלמנטים סיס-רגולטוריים מגוונים המקיימים אינטראקציה ביניהם. הפרוטוקול שלנו מאפשר לחקור כמותית אנשי קשר כרומטינים של לוצי נבחרים כגון מקדמים. טכניקה זו מאפשרת לנו לזהות ולכרות את תדרי האינטראקציה בין אלמנטים רגולטוריים שונים בו זמנית.
כדי ליצור גופים עובריים, להתחיל על ידי culturing תאי גזע עובריים עכבר ל 60% confluency. לאחר מכן להסיר את מדיום התרבות, ולשטוף פעמיים עם שני מיליליטר של PBS מעוקר. הסר את PBS לחלוטין, ולהוסיף שני מיליליטר של מדיום ניתוק התא.
דגירה צלחת התרבות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה במשך חמש דקות, מוסיפים שמונה מיליליטר של מדיום ההתבוללה EB לצלחת. כדי לנטרל את מושבות mESC כדי להשיג השעיה של תא יחיד, פיפטה המדיום למעלה ולמטה 15 עד 20 פעמים, ולהעביר את ההשעיה לצינור 10 מיליליטר.
צנטריפוגה התאים ב 300 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן הסר בזהירות את העל-טבעי. לאחר ספירת התאים, יש לעשות שימוש חוזר בכדור התא עם מדיום ההידול של EB.
היפוך המכסה של צלחת תרבות של 15 ס"מ. באמצעות פיפטה רב-ערוצית 200 מיקרוליטר, להפקיד 20-microliter טיפות של תאים בשימוש חוזר על המכסה. הפוך את המכסה בזהירות, והצב אותו על החלק התחתון של צלחת התרבות.
הדגירה את המנה עם טיפות תלויות במשך שלושה ימים. כדי לאסוף את התאים לאחר הדגירה, לשטוף את המכסה בעדינות עם 10 מיליליטר של PBS. העבר את PBS, אשר יכיל את EBs, לצינור פלסטיק 50 מיליליטר.
לאחר מתן הצינור לשבת במשך 30 דקות בטמפרטורות החדר, להסיר בזהירות את supernatant. האיי.בי.אס יישארו בתחתית הצינור. יש לעכל בעדינות את ה-EBs ב-10 מיליליטר של מדיום בידול EB טרי.
מעבירים את ההשעיה לצלחת פטרי בקטריולוגית באורך 10 ס"מ. שלושה עד שישה ימים לאחר מכן, להשתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לבדוק היווצרות EB. EBs צריך להיות עגול הומוגני בגודל.
לאסוף את EBs משתיים או שלוש מנות 10 ס"מ לתוך צינור פלסטיק 50 מיליליטר. צנטריפוגה EBs ב 300 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות להסיר את supernatant, ו resuspend EBs ב 10 מיליליטר של PBS.
צנטריפוגה EBs ב 300 פעמים g בטמפרטורת החדר שוב, הפעם במשך שלוש דקות. הסר את supernatant, ולהוסיף שני מיליליטר של טריפסין-EDTA לכדור. דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
במהלך הדגירה, פיפטה למעלה ולמטה כל שלוש דקות כדי לקבל השעיה של תא יחיד. כדי לעצור את התגובה טריפסין, להוסיף שמונה מיליליטר של מדיום ההידול EB. לאחר שימוש חוזר בתאים במדיום EB טרי, מוסיפים paraformaldehyde לריכוז סופי של 1%דגירה התאים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תחת סיבוב.
הרוו את הפורמדהיד על ידי הוספת גליצין לריכוז סופי של 0.125 טוחן. השלם את תהליך קיבוע כמתואר בכתב היד, ולאחר מכן הצמד להקפיא את כדורי התא בחנקן נוזלי. יש לעכל בעדינות את גלולת התא במאגר תיזה קר כקרח שהוכן זה עכשיו, ולהחמין את הצינור על קרח.
לאחר 15 דקות, צנטריפוגה התאים ב 1, 000 פעמים גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את העל-טבעי, ושטפו את גלולת הכדור עם 500 מיקרוליטרים של חיץ ת ליסיס קר. יש להתריע מחדש על גלולה בצינור 1.5 מיליליטר עם 50 מיקרוליטרים של 0.5% SDS במאגר 1x 2, ולמקם את הצינור בבלוק חימום ב 62 מעלות צלזיוס.
לאחר 10 דקות, להסיר את הצינור מבלוק החימום, ולהוסיף חיץ עיכול. מערבבים היטב על ידי צינורות, הימנעות קצף מוגזם, הדגירה את הצינור ב 37 מעלות צלזיוס. כדי להבטיח עיכול אנזים הגבלה יעיל, בפרוטוקול זה, כללנו שלב חוזר ונשנה של עיכול.
לכן חשוב גם לעכל היטב את הגרעינים במאגר העיכול. הוסיפו עוד 25 מיקרוליטרים של חיץ עיכול, ערבבו על ידי היפוך, וקלו שמונה מיקרוליטרים כפקד לא מעוכל. אחסן את דגימת הבקרה הלא מעוכלת ב-20 מעלות צלזיוס שליליות.
לאחר מכן, תוסיף כמה aliquots של אנזים ההגבלה Mbol, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס תחת סיבוב לאחר כל aliquot. קח שמונה מיקרוליטרים כדגימה של בקרה מתעכלת. כדי לבטל את ההצלבה של שתי דגימות הבקרה, הוסף 80 מיקרוליטרים של מאגר TE ב-10 מיקרוליטרים של פרוטאינאז K.Incubate ב-65 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
כדי לבדוק את יעילות העיכול, הפעל 20 מיקרוליטר aliquots על 0.6% ג'ל. עיכול מוצלח מראה שברים בעיקר בטווח של זוגות 3.0 עד 5.0 קילו-בבס. הכינו דנ"א לתיכון כמתואר בכתב היד.
השתמש sonicator כדי להפוך את ה-DNA לגודל של 150 עד 700 זוגות בסיס. העבר את הדנ"א המוקה לצינור מנעול בטוח חדש ונורמלי, המקבץ סוגים מרובים מאותה דגימה. מוסיפים חמוזי טיהור DNA מחוממים בכמות השווה לפי 1.8 מהנפח הקיים, ומערבבים על ידי שימוש חוזר.
לאחר חמש דקות של דגירה, לאסוף את חרוזים עם מתלה מגנטי. שמירה על הצינורות במתלה המגנטי, לשטוף את חרוזים פעמיים עם מיליליטר אחד של 80% אתנול מוכן טרי. לאחר ייבוש האוויר של החמוזים בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות, יש להניף את הדנ"א על ידי שימוש חוזר של חרוזים במאגר טריס 1x.
באמצעות שיטת הירידה התלויה, אוכלוסייה הומוגנית של EBs הושגה שישה ימים לאחר אינדוקציה של בידול ESC. אלקטרופורזה ג'ל בוצעה לאורך כל הפרוטוקול לבקרת איכות. עיכול יעיל על ידי Mbol גורם שברים של פחות משלושה זוגות קילו-בבס.
אלקטרופורזה לאחר קשירה הראתה כי רוב השברים היו גדולים משלושה זוגות קילו-באז. גדלי שברים של 400 עד 500 זוגות בסיסים צפויים לאחר sonication. לאחר dephosphorylation ו קשירה מתאם קצה יחיד, שני סיבובים של PCR בוצעו כדי להגביר את המטרות של עניין.
כל מטרה הוגברה בנפרד עם שני זוגות פריימר שונים, A ו- B עבור לוקוס Pou5f1 ו- C ו- D עבור לוקוס T. זה הביא למריחה DNA סביב 400 זוגות בסיס. לחלופין, PCR מולטיפלקס בוצע כדי להגביר מטרות A ו- C בו זמנית, וכתוצאה מכך גודל שבר דומה לאחר טיהור.
בפרופילי 4C אלה, התיבות הכחולות בהירות מציינות את המיקום של משפרי עם שינויים דינמיים במהלך ההידול. אזורי כרומטין ליצור קשר עם מקדמי Pou5f1 ו T גנים במהלך בידול EB. Pou5f1 היה מוסדר במהלך ההידול EB.
לעומת זאת, T היה מוסדר במהלך ההידול EB. עיכול אנזים הגבלה יעיל ולאחר מכן רצועות קרבה של DNA גנומי חוצה הם גורמים מרכזיים כדי להבטיח את ההצלחה של פרוטוקול זה. דבר נוסף הוא עיצוב פריימר לחקור את מפת הקשר של כל לוקוס.
הליך זה מתאים באופן אידיאלי לחקור מגע כרומטין בלוצי ממוקד. אם נדרשים שינויים גלובליים, ניתן לבצע גישות כלל-גנומית כגון Hi-C, לכידת מקדם Hi-C או HiChIP.
