Este método bioquímico permite la determinación del estado de palmitoilación de cualquier proteína de membrana expresada en el cerebro para la que se dispone de un anticuerpo adecuado. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere purificación de afinidad y en su lugar utiliza cambios en la movilidad del gel para determinar el número de modificaciones de una proteína de interés. Después de diseccionar el cerebro, homogeneizarlo inmediatamente en 10 mililitros de tampón de homogeneización en un homogeneizador de vidrio sobre hielo.
Usando aproximadamente 12 golpes, centrifugar los lysates durante 15 minutos a 1400 veces G, y cuatro grados Celsius. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo sobre hielo. Resuspender el pellet en 10 mililitros de tampón de homogeneización.
Homogeneizarlo usando aproximadamente seis golpes. Centrifugar la suspensión a 710 veces G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Combina los sobrenadantes y los centrifuga a 40.000 veces G y a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.
Deseche el sobrenadante y resusppend la fracción de membrana peletada en un tampón de homogeneización rompiendo el pellet con una punta de pipeta y pipeteando arriba y abajo. Realizar el ensayo ABCA para cuantificar los niveles de proteína. Para realizar el ensayo APEGS, coloque 470 microlitros de tampón A en un tubo de 1,5 mililitros y agregue aproximadamente 100 a 200 miligramos de proteína.
Sonicar el tubo y luego separar la proteína insoluble centrifugando el tubo a 25 grados Celsius y un mínimo de 13.000 veces G durante 10 minutos. Transfiera la proteína solubalizada a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. En primer lugar, interrumpir los enlaces de disulfuro incubando la proteína solubalizada en 25 microlitros de TCEP durante 60 minutos a 55 grados centígrados.
A continuación, bloquee los cicinos libres incubando la solución con 12,5 microlitros de la solución de stock de NEM durante tres horas a temperatura ambiente. A continuación, comenzar el proceso de precipitación de metanol cloroformo. Transfiera la solución proteica del tubo de 1,5 mililitros a un tubo de polipropileno o vidrio que se pueda centrifugar en un rotor de cubo oscilante a una velocidad modesta.
Agregue dos mililitros de metanol y vórtice brevemente. Añadir un mililitro de cloroformo y vórtice brevemente. A continuación, agregue 1,5 mililitros de agua desionizada y vórtice brevemente de nuevo.
Si es necesario, invierta el tubo para asegurar una mezcla exhaustiva. Centrifugar las muestras a 3000 veces G y 25 grados Celsius durante 30 minutos en un rotor de cubo oscilante. Retire y deseche cuidadosamente la fase superior de la solución en un tubo.
Añadir 1,5 mililitros de metanol. Mezclar suavemente pero a fondo por la inversión suave del tubo, teniendo cuidado de no fragmentar el panqueque de proteína opaca. Centrifugar la muestra a 3000 veces G y 25 grados Celsius durante 10 minutos en un rotor de cubo oscilante.
Con una pipeta serológica de vidrio, retire la mayor parte de la fase superior de la solución como sea posible sin alterar el panqueque proteico. Enjuague cuidadosamente el pellet con un mililitro de metanol y deje que se seque al aire durante al menos 10 minutos. Con la precipitación de metanol cloroformo completa, comience el escote de los enlaces de tioester de palmitoilo resusppendiendo el precipitado de proteína en 125 microlitros de tampón A.Transfer a un nuevo tubo de 1,5 mililitros.
Sonicar el tubo brevemente y luego centrifugarlo a 13.000 veces G o más o más y 25 grados Celsius durante 10 minutos para eliminar el material insoluble. Transfiera la proteína solubalizada a nuevos tubos de 1,5 mililitros y añada 375 microlitros de tampón H o tampón T.Después de incubar las muestras durante 60 minutos a temperatura ambiente, repita la precipitación de metanol cloroformo. Para añadir m-PEG a las ciisteínas desprotegidas, comience resuspendiendo el pellet en 100 microlitros de tampón A que contienen 10 mil o más TCEP.
A continuación, transfiera la suspensión a un tubo de 1,5 mililitros. Añadir 25 microlitros de la solución m-PEG 5K y mezclar por pipeteo. Incubar a temperatura ambiente con rotación de extremo sobre extremo.
Después de 60 minutos de incubación, retire m-PEG 5K no incorporado realizando de nuevo la precipitación de metanol cloroformo. Centrifugar a más de 13.000 veces G y 25 grados centígrados durante 10 minutos. Retire cuidadosamente la fase superior como antes, evitando el panqueque grueso y floculante.
Agregue un mililitro de metanol y mezcle suavemente pero a fondo. Centrifugar a más de 13.000 veces G y 25 grados centígrados durante 10 minutos. Retire cuidadosamente el sobrenadante y enjuague el pellet con un mililitro de metanol.
Una vez más, centrifugar a más de 13.000 veces G y 25 grados celsius durante 10 minutos. Después de secar al aire el pellet, resuspenderlo en 50 microlitros de tampón A sin TCEP o cualquier agente reductor. Reserve 5 microlitros de la solución para la cuantificación de proteínas BCA.
Después de la cuantificación, agregue una cantidad adecuada de búfer de muestra de 4x Laemmli. Cargue la muestra en un gel de página SDS. Utilice protocolos estándar de transferencia y detección de separación para la hinchazón occidental.
Para investigar el estado de palmitoilación de las proteínas SynDIG, las fracciones de membrana P2 de cerebros de ratón homogeneizados fueron sometidas al ensayo APEGS. La separación y el sondeo con anticuerpos demostraron que SynDIG1, SynDIG4 Prrt1 y Prrt2 están palmitoilados en el cerebro del ratón. El propósito de la precipitación de metanol cloroformo es evitar que un producto químico, como NEM, interfiera con el siguiente paso del protocolo.
Una precipitación adecuada de metanol cloroformo eliminará los productos químicos indeseables al tiempo que minimiza la pérdida de proteínas. Este método se puede aplicar a los licatos cerebrales de ratones de diferentes edades o de diferentes regiones cerebrales para investigar las regulaciones espaciales-temporales de la palmitoilación.
