Este método mejora la entrega de ácidos grasos a las células y las protege de los efectos tóxicos de la entrega de ácidos grasos libres, asegurando así un etiquetado más consistente. La sensibilidad y la eficiencia de la detección química de clics dependen de la absorción efectiva de la etiqueta de ácidos grasos. Hemos demostrado que esto se puede mejorar en gran medida.
Varios pasos del protocolo son muy específicos y deben seguirse de cerca. Una demostración visual puede aclarar y mostrar, por ejemplo, cómo evitar la formación de sólidos en la mezcla de etiquetado. Para preparar el medio de etiquetado, complemente DMEM con FBS recubierto de 5% de dextrano / carbón, estreptomicina de penicilina 1X, L-glutamina milimolar y piruvato de sodio de 100 milimolares, luego caliéntelo a 37 grados Celsius antes de usarlo.
Lave suavemente las células T HEK-293 chapadas un día antes en un plato de cultivo de tejidos de seis pocillos con PBS, luego reemplace el PBS con medios de etiquetado. Incubar las células a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente 45 minutos antes de proceder al etiquetado metabólico con ácidos grasos. Para saponificar los análogos de ácidos grasos, pipetee al menos dos microlitros del análogo de ácidos grasos alquilinos directamente en la parte inferior de un vial de reacción cónica de tres mililitros.
Pipetear una cantidad igual de hidróxido de potasio diluido cerca de la parte inferior del vial de reacción en el borde del vaso, de modo que el volumen dispensado del hidróxido de potasio se mezcle con el ácido graso. Cierre la tapa del vial y toque suavemente para mezclar las soluciones. Calentar el vial de reacción a 65 grados centígrados durante aproximadamente cinco minutos o hasta que la solución se aclare, lo que indica que se ha incorporado el ácido graso.
Sin embargo, tenga cuidado de que el líquido no se evapore demasiado. A continuación, la pipeta precalentó el 20% de BSA libre de ácidos grasos de tal manera que la relación de volumen de ácidos grasos a hidróxido de potasio a BSA libre de ácidos grasos es 1-1-50, logrando una concentración final de 20X ácidos grasos alquilinos unidos a BSA. Mezcle la solución mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo, luego incube durante 15 minutos a 37 grados centígrados.
Etiquete las células T HEK-293 agregando el ácido graso 20X BSA conjugado directamente en el medio de inanición para lograr una concentración final de 1% BSA en 25 miristato de alquililo micromolar o 100 palmitato de alquililo micromolar y estearato de alquilo. A modo de comparación, agregue líquidos no saponificados pipeteando dos microlitros de ácido graso sin etiquetar directamente en el medio de inanición, luego coloque las células nuevamente en la incubadora durante tres a seis horas. Después de que se complete la incubación, lave suavemente las células con PBS a temperatura ambiente, luego recolecte y lisa las células agregando 500 microlitros de tampón RIPA modificado sin EDTA y girando los lisados durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.
Centrifugar los lisados a 16,000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius, luego recoger el sobrenadante en tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitros y almacenarlos a menos 20 grados Celsius. Lleve de 50 a 100 microgramos de lisados de proteínas en tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitros a un volumen igual utilizando el tampón RIPA modificado libre de EDTA. Mantenga el volumen de reacción lo más pequeño posible.
Agregue STS a cada muestra para alcanzar una concentración final del 1%Prepare una mezcla maestra de los reactivos de clic y agregue los volúmenes apropiados en los lisados, luego mezcle mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Incubar los lisados en la oscuridad durante 30 minutos en un baño de agua de 37 grados centígrados con mezcla ocasional. Para la inmunoprecipitación, mezcle lisados con anti-GFP de conejo e incube durante la noche con rotación a cuatro grados centígrados.
Agregue de 15 a 20 microlitros de perlas magnéticas preequilibradas con 0.1% SDS RIPA a cada tubo y permita que reaccione extremo sobre extremo a cuatro grados Celsius durante tres horas. Lave las perlas con tampón de lisis y resuspón en 45 microlitros de tampón HEPES de 50 milimolares que contengan 1% de SDS. Calienta las cuentas a 80 grados centígrados durante 15 minutos.
Durante la incubación, invierta o agite los tubos aproximadamente cada cinco minutos, luego gire brevemente todos los tubos. Mientras las muestras aún están calientes, recoja el sobrenadante que contiene las proteínas. Combine 43 microlitros del sobrenadante con siete microlitros de la mezcla maestra de reactivos de clic y permítales reaccionar en la oscuridad durante 30 minutos a 37 grados centígrados.
En una gráfica occidental, se observó un efecto notable en la eficiencia del etiquetado para la detección de química de clics entre ácidos grasos alquilados saponificados y no saponificados con una longitud creciente de las cadenas de acilo. En las células marcadas con estearato de alquililo, la saponificación del ácido graso y la entrega con BSA para el etiquetado metabólico aumentaron drásticamente la detección de la señal de proteína S-acilada a través de la química del clic y la detección por una azitosonda fluorescente, lo que sugiere un aumento general en la incorporación celular de la etiqueta de ácido graso alquilino. Por el contrario, no se observaron diferencias notables en las células tratadas con el miristato de alquililo de ácidos grasos más corto y soluble.
Las células marcadas con palmitato de alquinol mostraron un aumento intermedio en la etiqueta en comparación con el miristato de alquinol, pero menos que el estearato de alquinilo. Es importante destacar que el tratamiento de las membranas de PVDF con hidróxido de potasio molar 0,1 eliminó en gran medida las etiquetas de ácidos grasos de las células incubadas con palmitato de alquililo y estearato de alquililo, confirmando que la mayor parte de la señal fue a través de un enlace éster o tioéster. Como era de esperar, la incorporación de miristato de alquililo fue en su mayoría resistente a los álcalis debido a la unión del miristato a las proteínas a través de un enlace amida.
Siguiendo la química del clic, se detectó miristoilación de la GFP de Huntington C-terminal miristoilada de tipo salvaje en los inmunoprecipitados, así como en los lisados, mientras que la mutación G2A bloqueó completamente la miristoilación de la GFP C-terminal de Huntington. Siguiendo la química del clic, podemos realizar la purificación por afinidad de proteínas aciladas grasas para espectrometría de masas. Esto puede producir un perfil diferente de proteínas aciladas grasas al proteger a las células de la toxicidad.
