La captura asistida de acil-resina o Acyl-RAC es un método sensible y fiable que se puede utilizar para detectar la proteína S-acilación en una variedad de muestras biológicas. Este protocolo evita algunas de las limitaciones del etiquetado metabólico y el etiquetado radioeléctrico, y permite la detección simultánea de S-acilación de múltiples proteínas. No sólo células vivas, sino también tejidos primarios y muestras congeladas.
La acilación S puede regular una variedad de procesos celulares como el tráfico de proteínas, la focalización de la membrana plasmática, la transducción de señales, el transporte de hierro y las interacciones proteína-proteína. Es importante utilizar una solución de hidroxilamina recién preparada con pH cuidadosamente ajustado para cada experimento para asegurar un escote eficiente y específico del enlace de tioester. Con una demostración de este método es fundamental para pasos como cloroformo, precipitación de metanol.
El pellet de forma de panqueque obtenido durante este paso debe manejarse con mucho cuidado. Puede ser frágil y la pérdida parcial de la muestra durante el paso puede conducir a una recuperación de la muestra desigual. Demostrar el procedimiento estará Savannah West, una estudiante graduada de nuestro laboratorio.
Para obtener los lysates celulares, recoja las células de interés en un tubo de centrífuga cónica. Y retire los restos celulares por centrifugación. Lavar el pellet en 5 mililitros de PBS.
Y resuspender inmediatamente las células en 600 microlitros de tampón de lelisis recién preparado. Agitar la muestra a 1.500 revoluciones por minuto en un agitador térmico durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Antes de limpiar los lysates, detergente de pellets y material soluble por centrifugación.
Al final de la centrifugación, recoger el izado despejado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros preenfriado sobre hielo. Y realizar un ensayo de Bradford o ácido bicinchoninic para estimar la concentración de proteínas de acuerdo con los protocolos estándar. Añadir metanol y cloroformo para el izado en una proporción de 2:1.
Agitar rigurosamente para crear una suspensión homogénea y centrifugar la muestra para recoger un pellet de proteína en la interfaz entre las fases acuosa y orgánica. Inclinar el tubo, utilizar una aguja o una punta de carga de gel para aspirar tanto disolvente como sea posible. Seque al aire el pellet proteico durante unos minutos.
Antes de mezclar suavemente el contenido del tubo con 600 microlitros de metanol, teniendo cuidado de no romper el pellet. Después de retirar cuidadosamente el lavado de metanol, seque el pellet proteico en una mesa de banco durante aproximadamente cinco minutos. A continuación, resuspender el pellet de proteína en 200 microlitros de tampón 2SHB.
Y vórtice a 42 grados Celsius y 1.500 revoluciones por minuto en un agitador térmico. Cuando el pellet se disuelva, agregue 200 microlitros de 0.2%MMTS en 2SHB a la muestra. E incubar la proteína durante 15 minutos a 42 grados Celsius y 1.500 revoluciones por minuto en un agitador térmico.
Al final de la incubación, realizar 3:4 precipitaciones de cloroformo-metanol como se demuestra. Para eliminar el MMTS, disuelva el pellet en 100 microlitros de tampón 2SHB fresco con vórtice. Y diluir la muestra con 300 microlitros de tampón A después de cada precipitación.
Después de la precipitación final, disolver las muestras en 200 microlitros de tampón 2SHB y diluir con 240 microlitros de tampón A.Medir la concentración de proteína de nuevo y reservar 40 microlitros de cada muestra como controles de entrada. Divida las muestras en dos volúmenes iguales de 200 microlitros. Y marcar los tubos como más hidroxiamina y menos hidroxiamina.
Añadir 50 microlitros de dos hidroxiamina molares neutrales recién preparados a una concentración final de 400 mililitros al tubo de hidroxilamina más. Y 50 microlitros de cloruro de sodio molar neutro al control negativo, un tubo menos hidroxiamina. A continuación, agregue 30 microlitros de lodo de perlas TS a cada tubo.
Y gire los tubos durante una o dos horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación lavar las cuentas cuatro veces con 1%SDS en el tampón A para eliminar cualquier hidroxilamina residual. Después del último lavado, lave todas las muestras de cuentas con tres microcentrifugaciones suaves de un minuto.
Aspirar cuidadosamente los sobrenadantes y resuspender las perlas en 500 microlitros de 1%SDS en el tampón A en cada lavado. Después del último lavado, gire suavemente hacia abajo las cuentas como se ha demostrado. Y aspirar tanto sobrenadante como sea posible sin alterar las cuentas.
Para recuperar las proteínas de las perlas, agregue 50 microlitros de tampón de muestra 4%SDS a cada tubo e incubar las muestras a 80 grados Celsius y 1.500 revoluciones por minuto durante 15 minutos en un agitador térmico. Al final de la incubación, deje que las muestras se enfríen antes de centrifugar para peletizar completamente las perlas. Luego usa una punta de carga de gel para transferir las proteínas eluidas a nuevos tubos de 1,5 mililitros.
Y ejecuta las muestras en un gel SDS-PAGE para analizar la S-acilación de las proteínas de interés por western blotting. La tirosina quinasa Lck se puede detectar en licanatos tratados con dos hidroxiamina molares neutrales. para cortar el enlace de tioester entre los residuos de cisteína y la mitad de ácidos grasos.
El despojo y el reproche con anticuerpos contra proteínas Fyn y LAT demuestran que el ensayo de captura asistida por acil-resina se puede utilizar para analizar la Acilación S de múltiples proteínas al mismo tiempo. Además, la Acilación S de Lck, Fyn y LAT se puede detectar fácilmente en los splenocitos primarios de ratón. Indicando que esta modificación se conserva entre dos especies.
Además de la identificación de nuevas proteínas S-aciladas, este método también se puede utilizar para evaluar los cambios en la proteína S-acilación en diferentes condiciones biológicas. El número de proteínas S-aciladas recién identificadas ha aumentado enormemente después de que el doble significado una técnica rápida y confiable como Acyl-RAC. Además de la identificación de nuevas proteínas S-aciladas, este método también se puede utilizar para evaluar los cambios en la proteína S-acilación en diferentes condiciones biológicas.
