Nuestro protocolo in situ es significativo porque proporciona una forma sencilla de visualizar patrones de expresión génica con una tinción de fondo mínima. Esta técnica hace que un protocolo complicado y largo sea relativamente fácil de realizar. Las sugerencias de configuración de sobremesa y las listas de comprobación proporcionadas hacen que este protocolo sea aún más fácil de realizar correctamente y reproducir.
Si bien las técnicas que se muestran aquí son específicas de Astyanax mexicanus, es probable que se adapten a otros sistemas de individuos de tamaño comparable con pequeños ajustes al protocolo. En primer lugar, utilice cinta de laboratorio de color para designar viales y pipetas para cada gen. Usando una pipeta Pasteur, clasifú los embriones.
Por lo general, no hay más de 12 embriones por vial, una vez clasificados. A continuación, establezca un baño de agua agitado a 70 grados centígrados. Extraiga cuidadosamente el metanol en los viales de embriones clasificados, y reemplácelo con 500 microlitros de metanol fresco 100%.
Lave los embriones brevemente durante aproximadamente un minuto en una coctelera de plataforma. Después de esto, rehidratar los embriones en una concentración creciente de 1x PBS con Tween 20 en un agitador de plataforma como se describe en el protocolo de texto. Para comenzar, coloque una pequeña junta con un fondo de malla en el baño de agua giratorio que se ha precalentado a 70 grados centígrados.
Coloque alícuotas de búfer de hibridación menos e buffer de hibridación más en la junta. Añadir suavemente una solución de PK preparada a los viales de embriones para asegurar que todos los tejidos estén completamente cubiertos de solución. Transfiera los viales a una coctelera de plataforma y déjelos digerir en la solución de trabajo de proteinasa K durante aproximadamente 12 minutos.
Después de esto, extraiga suavemente la solución PK e inunde brevemente el vial con PBT para diluir el PK restante. Sustituya la solución PBT por 500 microlitros de PBT fresco y deje que la solución enjuague en la coctelera de plataforma durante cinco minutos. A continuación, sustituya la solución PBT por 500 microlitros de descongelado 4%PFA. Deje que los embriones se incuban en el agitador de plataforma a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Para comenzar la pre-hibridación, añada 500 microlitros de tampón de hibridación precalentado menos solución a los viales que contienen embriones. Coloque cuidadosamente los viales en la junta en el baño de agua a 70 grados centígrados sin agitar durante cinco minutos. A continuación, extraiga el tampón de hibridación menos solución e inunde los viales con 500 microlitros de tampón de hibridación preadnciado más solución.
Vuelva a colocar los viales en la junta en el baño de agua e incubar con agitación durante cuatro horas o durante la noche. Para comenzar la hibridación, extraiga el búfer de hibridación más de los viales y sustitúyalo por 500 microlitros de tampón de hibridación precalentado fresco más. Agregue cuidadosamente dos microlitros de sonda de ARN a cada vial y gire suavemente para asegurar una distribución uniforme de la sonda.
Incubar en el baño de agua a 70 grados centígrados durante la noche mientras se agita a 40 RPM. Para empezar, prepare tubos de microcentrífuga etiquetados como tampón de hibridación más con el gen de la sonda de ARN de interés como se describe en el protocolo de texto. Establezca dos tubos cónicos de 15 mililitros y añada 0,2 gramos de reactivo de bloqueo y 10 mililitros de MABT.
Coloque ambos tubos en un mezclador nutating hasta que el reactivo se disuelva completamente en la solución. Con una pipeta Pasteur de vidrio, extraiga el tampón de hibridación más y la solución de sonda y colóquelo en un tubo de microcentrífuga etiquetado estéril. Guarde este tubo en el congelador a menos 20 grados centígrados para su uso futuro.
Agregue cuidadosamente 500 microlitros del citrato de sodio salino caliente y el tampón de hibridación menos diluciones. Incubar en soluciones secuenciales durante 10 minutos cada una en el baño de agua agitada, y luego a temperatura ambiente en una coctelera de plataforma como se describe en el protocolo de texto. Después de la última incubación, sustituya el 100% PBT de cada vial por 500 microlitros de MABT.
Repita este proceso dos veces durante cinco minutos cada uno. En primer lugar, retire el MABT de cada vial e inunde con una solución de bloqueo premezclada de uno de los tubos cónicos de 15 mililitros. Coloque ambos viales en el mezclador nutating durante cuatro horas a temperatura ambiente.
Añadir dos microlitros de los fragmentos de anticuerpos al segundo tubo de solución de bloqueo preparada y vórtice brevemente. A continuación, llene cada vial casi por completo con solución de bloqueo y colóquelos en un mezclador nutrido durante la noche en un refrigerador a cuatro grados centígrados. Para comenzar, prepare un vial de 10%NGS en MABT.
Sustituya la solución de bloqueo de cada vial por 500 microlitros de esta solución NGS. Incubar a temperatura ambiente en la coctelera de plataforma durante 25 minutos. Después de esto, reemplace la mezcla NGS con 500 microlitros de 100%MABT.
Incubar en la coctelera de plataforma a temperatura ambiente durante 30 minutos. Repita este enjuague 11 veces más durante todo el día, cada 30 minutos. A continuación, llene cada vial con 100% MABT y colóquelos en un mezclador nutating durante la noche en un refrigerador a cuatro grados centígrados.
En primer lugar, reemplace el MABT en cada vial con un mililitro de tampón AP y déjelo lavar durante cinco minutos. Repita este lavado dos veces para retirar completamente el MABT. Entonces substituya el buffer AP con un mililitro del buffer AP fresco que contiene 3.5 microlitros del BCIP y 4.5 microlitros del MBT.
Sustituya esto por una mezcla fresca de tampón AP que contenga el BCIP y el MBT cada hora hasta que se complete la reacción, asegurándose de monitorear la reacción de cerca y comprobar cada 15 minutos hasta que se haya alcanzado el nivel deseado de tinción. Detenga la reacción de coloración enjuagando los embriones en una concentración creciente de 1X PBT en el búfer AP como se describe en el protocolo. Enjuague los embriones en aproximadamente cinco mililitros de 100% PBT en un mezclador nutating hasta que se alcance la tinción mínima de fondo deseada.
Cuando el enjuague esté completo, lave los embriones en 500 microlitros de PBS estériles en un agitador de plataforma y coloque las muestras como se describe en el protocolo de texto. Después de enjuagar los embriones, colóquelos en cuatro mililitros de PBS 100% estéril y, si es necesario, guárdelos a largo plazo a cuatro grados centígrados. En este estudio, los especímenes embrionarios de Astyanax están etiquetados para el análisis de expresión génica de alta calidad.
Este proceso se ha implementado con éxito tanto en el pez cueva de Pachon como en los embriones de peces de superficie. Los embriones de pez cueva etiquetados para la expresión Sox9 demuestran un etiquetado claro en los arcos ramificados en desarrollo y la aleta pectoral. Tenga en cuenta que la tinción está prácticamente ausente en el saco de yema o en las somitas en desarrollo en el flanco.
Del mismo modo, la expresión de Tfap2a es evidente en las porciones de la cabeza en desarrollo como células de cresta neural de migración temprana a lo largo de la región del flanco dorsal del embrión. El tercer gen presentado para los embriones de pez cueva, Phf20a, se observa en las porciones del mesodermo somático y la cabeza posterior que están destinados a dar lugar a tejido óseo. Los embriones de peces de superficie etiquetados para CXCR muestran un etiquetado positivo en regiones aisladas de la cabeza y el flanco, así como algunas células individuales que cubren el saco de yema.
El gen Adcyap1a se expresa en regiones del sistema nervioso central, incluidas las células pituitarias. Observe la expresión altamente específica en grupos bilaterales emparejados de células en el aspecto dorsal del embrión, así como una región más grande de expresión de línea media. El último gen examinado para los embriones de pez cueva, Sox10, es evidente como un marcador temprano de la cresta neural en los lados izquierdo y derecho del embrión dorsal.
Después de completar in situ, normalmente imagen de nuestros resultados utilizando microscopía de luz. Lo mejor es hacer esto dentro de las dos semanas después de la finalización con el fin de evitar la degradación de la tinción.
