Este protocolo es significativo porque permite la determinación de la expresión génica en larvas y juveniles de pez cebra más viejos durante la metamorfosis. La ventaja de esta técnica es que se han optimizado varios pasos para la penetración de la sonda y la visualización del riñón. Para comenzar, configure el pez cebra adulto para que se aparee agregando un pez macho y una hembra en un tanque de apareamiento al final de la tarde después de su última comida.
Al día siguiente, recoge los embriones en placas de Petri que contengan medio E3. Cinco días después de la fertilización, coloque una pantalla de 400 micrómetros en un tanque de 2.8 litros y llénelo con 2 centímetros de agua del sistema. Luego agregue la larva de una placa de Petri.
Para fijar la larva, retire un tanque de larva en el punto de tiempo deseado, luego, usando una red y una pipeta de transferencia con su punta cortada, transfiera la larva a la placa de Petri. A continuación, agregue dos mililitros de 2% de tricaína para inmovilizar la larva. Después de la inmovilización, reemplace la tricaína con 20 mililitros de solución de fijación.
Después de 30 minutos, transfiera la larva a un tubo de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de solución de fijación fresca. Luego, asegurándose de que la tapa esté apretada, balancee lentamente el tubo a cuatro grados centígrados durante dos días. En el tercer día, reemplace la solución de fijación con 20 mililitros de PBST y luego transfiera la larva a una placa de Petri.
Para medir la larva, coloque la placa de Petri encima de una regla plana bajo un microscopio de disección, luego, usando un manipulador de pestañas, mueva cada larva sobre la regla para medir su longitud total. Después de medir todas las larvas, combine varias larvas de longitudes similares en un vial de vidrio de 5,5 mililitros con PBST. Para la deshidratación, reemplace el PBST en el vial de vidrio con cuatro mililitros de metanol al 100%, luego guarde el vial a menos 20 grados Celsius durante dos días.
Para la rehidratación, reemplace el 100% de metanol con cuatro mililitros de una solución de 75% de metanol y 25% de PBST y mueva el vial durante cinco minutos. Luego, reemplace la solución de metanol y PBST con cuatro mililitros de PBST fresco y vuelva a mecer el vial durante 10 minutos. Para la digestión de la proteinasa K, reemplace el PBST con dos mililitros de una solución de proteinasa K y mueva el vial a temperatura ambiente durante 30 minutos.
A continuación, para el blanqueamiento, transfiera la larva a una placa de seis pocillos y reemplace el PBST con tres mililitros de solución blanqueadora fresca. Después de la desaparición completa de la pigmentación a lo largo de los mesonephros, transfiera la larva de nuevo a un vial de vidrio, reemplace la solución blanqueadora con cuatro mililitros de PBST y mueva el vial durante 10 minutos. Para la predihridación, reemplace la solución de fijación con cuatro mililitros de PBST y mueva el vial durante 10 minutos, luego, reemplace el PBST con cuatro mililitros de Hyb-solution y roca durante 10 minutos.
Después de dos incubaciones adicionales en la solución Hyb, reemplace la solución con cuatro mililitros de la solución Hyb +. Diluya simultáneamente la sonda de fluoresceína EGFP de uno a 100 en 500 microlitros de hibridación más solución, e incube el vial y la sonda a 70 grados Centígrados durante la noche. Al día siguiente, para hibridar la sonda, reemplace la solución Hyb+ en el vial con la sonda precalentada e incube a 70 grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, agregue 50 mililitros de SSCT precalentado 0.2 veces en un tubo de 50 mililitros. Luego, inserte un colador celular de 100 micrómetros en la parte superior del tubo, transfiera la larva del vial de vidrio al colador celular y, asegurándose de que la larva esté sumergida en el tampón, incube el vial a 70 grados centígrados durante dos horas. Después de la incubación, transfiera el colador celular a un nuevo tubo que contenga 0,2 veces SSCT precalentado e incube de nuevo a 70 grados centígrados durante dos horas.
A continuación, para el bloqueo, transfiera la larva a un nuevo vial de vidrio y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Luego, reemplace la solución de SSCT 0.2 veces con cuatro mililitros de una solución de SSCT al 67%0.2 veces y una solución de MABT al 33% y balancee el vial a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, reemplace la solución SSCTT MABT con cuatro mililitros de MABT fresco e incube el vial en un balancín durante 10 minutos.
Luego, reemplace el MABT con cuatro mililitros de solución de bloqueo e incube cuatro grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, reemplace la solución de bloqueo con una solución de anticuerpos e incube a cuatro grados centígrados durante dos días. Para el lavado de anticuerpos, transfiera la larva a un tubo de 50 mililitros, luego agregue 40 mililitros de PBST2 y coloque el tubo tendido de lado para la incubación nocturna a cuatro grados centígrados.
El día 12, después de transferir la lava a una placa de seis pocillos, reemplace el PBST2 con tres mililitros de tampón de tinción. Después de una incubación de cinco minutos en un balancín, reemplace el tampón de tinción con tres mililitros de la solución de tinción. Cuando se alcance la intensidad de tinción deseada, reemplace la solución de tinción con tres mililitros de la solución de parada y roca durante 30 minutos.
Luego, transfiera la larva a un nuevo vial de vidrio, reemplace la solución de parada con cuatro mililitros de solución de fijación fresca e incube durante una hora a temperatura ambiente. Para la obtención de imágenes, reemplace la solución de fijación con cuatro mililitros de PBST fresco. Después de una incubación de 10 minutos en un balancín, transfiera la larva a una placa de seis pocillos, luego reemplace el PBST con cuatro mililitros de PBST fresco y vuelva a mecer el plato durante 10 minutos.
A continuación, agregue tres mililitros de glicerol al 50% en PBST y roca durante 10 minutos, luego, usando un microscopio de disección, obtenga una imagen de la larva directamente en la placa de seis pocillos. Este protocolo de hibridación in situ etiqueta eficazmente las células progenitoras renales y varias estructuras de nefrona utilizando el desarrollo de mesonephros. La nefrona mesonéfrica inicial se forma a aproximadamente 5,2 milímetros dorsales de los pronefros.
Los grupos de células progenitoras están presentes durante el desarrollo de mesonephros, además de las células progenitoras individuales. En los juveniles más grandes, la tinción de fondo puede ocurrir en los somitas. En general, este método se puede utilizar para estudiar otros tejidos que se forman durante la metamorfosis, además de los órganos adultos disecados.
