La cantidad de información de un solo experimento es enorme. Podemos detectar la presencia de estos polímeros de pared celular y saber exactamente cómo se distribuyen en células y tejidos, e incluso determinar su abundancia. Este método está diseñado de tal manera que se puede aplicar a casi cualquier tipo de tejido vegetal de cualquier especie que uno pueda querer analizar.
La inmunolocalización en los tejidos vegetales implica mucho trabajo meticuloso, difícil de explicar sin ver realmente lo que sucede. Antes de recoger la muestra de tejido vegetal, llene un vial de vidrio con suficiente solución fijativa en frío para sumergir completamente todas las muestras. A continuación, seleccione los tejidos vegetales que desea analizar y recorte las muestras a un tamaño no superior a 16 milímetros cuadrados.
Sumerja inmediatamente las muestras en la solución fijativa. El glutaraldehído y el formaldehído son excelentes fijativos, pero ambos son peligrosos y deben ser manejados en la campana de flujo. Transfiera el vial a una cámara de vacío y aplique lentamente el vacío.
Cuando la presión alcanza los pascales negativos de 60 kilos, el material flotante en el vial comenzará a hundirse hasta el fondo. Mantenga la presión en la cámara en no más de 80 kilos de pascales negativos. El proceso de hundimiento puede tardar hasta dos horas.
Después de que las muestras hayan estado en la cámara de vacío durante dos horas, suelte lentamente el vacío. Sella el vial de vidrio y refrigerarlo durante la noche a cuatro grados centígrados. Después de la fijación durante la noche, deseche cualquier muestra que no se hundiera en la parte inferior del vial.
Lave las muestras restantes con 25 PBS mililitroles durante 10 minutos y luego lávelas en 25 mililitros durante 20 minutos. Es extremadamente importante eliminar todas las muestras flotantes porque es muy probable que el fijador no haya penetrado en la muestra. Deshidratar las muestras en una serie de etanol, sumergiendo las muestras durante 20 minutos en cada concentración de etanol.
Para perfundir las muestras, agregue concentraciones crecientes de resina LR-blanca en etanol, comenzando con una parte de resina a tres partes de etanol. En cada concentración, incuba durante 24 horas a cuatro grados centígrados. Reemplace la resina LR-blanca por resina fresca e incuba las muestras durante 12 horas adicionales a cuatro grados Centígrados.
Prepare las cápsulas de gelatina de incrustación, seleccionando cápsulas ligeramente más grandes que las muestras para que las muestras puedan estar completamente encerradas en la resina. Etiquete las etiquetas de papel con lápiz porque la tinta contaminará la resina. Aplique una gota de resina fresca LR-blanca en la parte inferior de cada cápsula.
Coloque una muestra en cada cápsula y, a continuación, llene las cápsulas a la máxima capacidad con resina fresca. Coloque la tapa en la cápsula y presione suavemente para sellarla. Para polimerizar la resina, cura las cápsulas a 58 grados Celsius hasta que estén completamente endurecidas alrededor de 24 a 48 horas.
Después de pelar la cápsula de gelatina de la resina LR-blanca, coloque el bloque de resina debajo del microscopio estéreo. Con una cuchilla de afeitar afilada, recorte el bloque blanco LR en un ángulo de 45 grados a la muestra. Gire la muestra y haga un segundo corte en un ángulo de 90 grados hasta el primero.
Continúe cortando en el mismo patrón para formar una pirámide con el ápice de la pirámide directamente por encima del área de interés de la muestra, luego comience a eliminar rodajas finas perpendiculares al eje principal hasta que la superficie de corte llegue a la muestra. Idealmente, la muestra objetivo debe estar encerrada en una forma trapezoidal. Coloque el bloque de resina recortada en el microtome ultra.
Ajuste el ángulo entre el borde del cuchillo y el bloque de resina. Corte secciones del bloque con un espesor entre 200 y 700 nanómetros. Utilice un bucle de alambre para levantar cuidadosamente algunas secciones muestreada del microtome.
Colóquelos en una gota de agua desionizada destilada en un tobogán de vidrio. Evapore el agua colocando el tobogán en una placa caliente a 50 grados Celsius, luego agregue una gota de mancha a las secciones. Después de 30 segundos, enjuague la mancha y observe la diapositiva debajo del microscopio para verificar el estado general de la sección y que la estructura de la planta deseada sea visible.
Prepare un tobogán de reacción limpio colocando una gota de agua desionizada destilada en cada pozo del tobogán. Transfiera una o dos secciones de muestra a cada gota de agua. Coloque el tobogán en una placa petri cuadrada de 10 centímetros, cúbralo y déjelo secar a 50 grados centígrados.
Para preparar una cámara de incubación para los toboganes de reacción, coloque algunas toallas de papel humedecidas en la parte inferior de una caja de puntas de pipeta y envuelva la caja con papel de aluminio. Transfiera las diapositivas de la caja a la cámara de incubación. Pipeta 50 microlitros de solución de bloqueo en cada pozo.
Después de incubar la diapositiva durante 10 minutos, retire la solución de bloqueo y, a continuación, lave todos los pozos dos veces con PBS durante 10 minutos cada vez. Después de preparar las principales soluciones de anticuerpos como se describe en el manuscrito, realice un lavado final de los pozos con agua desionizada destilada durante cinco minutos. Pipetear la solución principal de anticuerpos en los pozos de reacción, luego pipetear la solución de bloqueo en los pozos de control.
Cierre la cámara de incubación. Deje reposarlo durante dos horas a temperatura ambiente y luego refrigerarlo durante la noche a cuatro grados centígrados. Prepare una solución del 1% del anticuerpo secundario en la solución de bloqueo.
Se necesitarán aproximadamente 40 microlitros por pozo. Cubra la solución con papel de aluminio. Lave los pozos de la reacción dos veces con PBS y una vez con agua desionizada destilada durante 10 minutos cada vez.
Asegúrese de que ninguna solución de bloqueo o depósitos permanezcan en los pozos. Pipetear la solución secundaria de anticuerpos en todos los pozos. Incubar los toboganes en la oscuridad a temperatura ambiente durante tres a cuatro horas.
Una vez más, lave los pozos de la reacción deslice dos veces con PBS y una vez con agua desionizada destilada, luego agregue una gota de Calcofluor White a cada pozo. Sin lavar, agregue una gota de medio de montaje a cada pozo y cubra cada pozo con un coverlip. Observe las secciones de muestra en la diapositiva de reacción utilizando un microscopio de fluorescencia.
Para cada observación, utilice un filtro UV para detectar paredes celulares manchadas por el Calcofluor y un filtro FITC para detectar la inmunolocalización. Para una mejor visualización de los resultados, utilice ImageJ o un programa de análisis de imágenes similar para combinar cada imagen de filtro UV con la imagen de filtro FITC correspondiente. Al identificar la localización de epítopos específicos, el protocolo permite la caracterización de la composición de la pared celular.
Por ejemplo, 1, 5-arabinan es abundante en la pared celular del anéter quercus suber en desarrollo. Los homogalacturonans apenas esterificados se encuentran típicamente en la punta raíz del embrión suber Quercus especificando las propiedades mecánicas del órgano. Los xylogalacturonanos se encuentran en células degenerantes, como la célula endosperm durante las etapas finales de la maduración de bellota de suber Quercus.
Los epítopos de AGP reconocidos por JIM13 o JIM8 se encuentran en estructuras relacionadas con la reproducción, tales como líneas celulares relacionadas con la microgametogénesis en Arabidopsis thaliana y las papilas estigmatizas y microbianas de la angiospermo basal Trithuria submersa. Los errores comunes en la implementación de este protocolo suelen ser fáciles de detectar e identificar. Cuando se omiten los lavados o se permite que los pozos de reacción se sequen, el anticuerpo secundario generalmente aparecerá como un frotis.
Se formarán agregados de fluorocromo verde si el anticuerpo primario no consolidado no se lava correctamente. El plegado o desprendimiento de las secciones suele estar relacionado con una mala adherencia debido al uso de toboganes impuros o lavado agresivo. La preparación de la muestra también es fundamental.
Los bloques de resina deben estar libres de grietas con una muestra claramente visible de color amarillo pálido a marrón claro. Las muestras incrustadas ineficientemente mostrarán manchas o áreas blancas polvorientas. Mantener el tamaño de la muestra por debajo de ocho milímetros es esencial para la penetración de la solución fija.
Las muestras mal fijas aparecerán de color marrón oscuro o casi negro. La temperatura excesiva puede hacer que la resina se agriete haciendo imposible la sección de la muestra. El uso de técnicas de inmunolocalización abre varias direcciones de investigación.
Uno puede seguir con técnicas más específicas como el análisis bioquímico de la pared celular o incluso proceder a un enfoque molecular. Los resultados proporcionados por esta técnica pueden ayudar a entender la composición de la pared celular, una estructura extremadamente compleja muy difícil de analizar mediante un simple análisis químico.
