Este protocolo es significativo ya que permite identificar la interacción planta-hongo. Además de colorear la pectina, también demuestra defectos en el polímero de la pared celular del patógeno y permite la identificación de estructuras de hongos. Esta técnica simple y sin complicaciones se puede realizar utilizando microscopía de luz y no requiere ningún equipo costoso, como el microscopio electrónico de barrido.
Además, es una técnica rápida que obtiene una excelente distinción de estructuras vegetales para estudios histopatológicos. La técnica identifica la interacción planta-hongo. De ahí que colabore en el diagnóstico de las enfermedades causadas por hongos biotróficos y necrotróficos como la roya del café y la cercosporiosis.
Para comenzar, cosecha una muestra de hoja de aproximadamente 10 milímetros cuadrados en la región media de la lesión con un bisturí y una pinza, y sumérgela en 30 mililitros de solución fijadora Karnovsky. Someta la muestra de hoja a un bajo vacío de 500 a 600 milibares durante 15 minutos utilizando una bomba de aceite, al menos cuatro veces para aumentar la permeabilidad de la solución fijadora en el tejido de la hoja. Después de la fijación, lave la muestra de la hoja tres veces en tampón de cacodilato de 0,5 M diluido en agua destilada durante cinco minutos cada uno, y luego transfiérala a una serie etanólica graduada durante 15 minutos en cada concentración de etanol.
Para transferir gradualmente las muestras al metacrilato de glicol, haga la Solución A mezclando un gramo de polvo de metacrilato de glicol con 100 mililitros de resina básica bajo agitación magnética. Luego, sumerja las muestras en una proporción de uno a dos de Solución A y 100% etanol durante tres horas. Sumerja las muestras en una proporción de uno a uno para la solución A: 100% etanol durante tres horas, luego sumérjalas en una resina básica pura durante dos a cuatro días.
Someta la muestra a un vacío bajo al menos cuatro veces al día durante 15 minutos, seguido de rotación. Mezclar 15 mililitros de la Solución A con un mililitro del endurecedor en un vaso de precipitados con rotación durante dos minutos para producir la Solución de polimerización B.Poner 1,2 mililitros de esta Solución de polimerización B en moldes de plástico. Usando un pico de madera, transfiera las muestras de hojas lesionadas de resina básica pura a la Solución B y evite el uso de pinzas, ya que pueden causar aplastamiento de tejidos.
Asegúrese de orientar rápidamente las muestras de hojas perpendiculares a los moldes de plástico, ya que la Solución B se vuelve viscosa rápidamente. Cuando se logre la orientación perpendicular de las muestras de hojas, espere 30 minutos y luego transfiera el molde de plástico a una cámara de plástico o vidrio que contenga gel de sílice para evitar la humedad. Una vez que la resina y la muestra de la hoja se polimerizan después de dos o tres horas, separe el bloque resultante del molde de plástico lijando la base del bloque con una lima de lijado.
Luego, pegue el bloque a un trozo de madera. Corte el bloque en secciones de cinco micrómetros de espesor utilizando un microtomo giratorio equipado con cuchillas de acero de ocho centímetros. Coloque las secciones en toboganes de vidrio cubiertos con agua destilada.
Luego, transfiera las diapositivas a una placa caliente para que se sequen a 40 grados centígrados y promuevan la adhesión de las secciones a las diapositivas de vidrio. Después del secado, etiquete las diapositivas de vidrio con el nombre de referencia del bloque y el número de diapositiva. Cubra las secciones con dos mililitros de azul de algodón al 5% en lactofenol y caliéntelas en una placa caliente a 45 grados centígrados durante cinco minutos.
Retire el exceso de tinte lavando el portaobjetos tres veces en un vaso de precipitados lleno de agua destilada. Mancharlo con dos mililitros de rojo rutenio al 0,01% en agua durante un minuto. Retire el exceso de tinte lavando el portaobjetos tres veces en un vaso de precipitados lleno de agua destilada.
Coloque una gota de agua destilada sobre las secciones y cubra las secciones con un resbalón de cubierta para realizar análisis de microscopía de luz. En el método de doble tinción, las hifas de Hemileia vastatrix que contenían paredes celulares y el denso contenido de protoplastos aparecieron de color azul oscuro tanto en el parénquima esponjoso como en el de empalizada. La célula madre de haustorium y la haustoria también exhibieron un color azul oscuro.
La contramancha con rojo rutenio definió claramente la distribución fúngica en los espacios intercelulares. Durante la interacción, la célula madre de Hemileia vastatrix haustorium rompió la pared celular huésped y desarrolló un cuello haustorial rodeado de compuestos pécticos. La encapsulación de color rosa-rojo rica en pectina del cuello haustorial no puede prevenir la formación haustorial.
En algunos casos, la encapsulación rica en pectina encerró el haustorio incompletamente. Y en algunos casos, el haustorio está completamente encapsulado. La pared celular rica en pectina mantiene la integridad en el borde de la lesión, donde el hongo no está presente.
El método de doble tinción demostró la presencia de hifas intercelulares. En las zonas de interacción, las paredes celulares de pectina parecían perder su integridad debido a la disolución. Las estructuras reproductivas como los conidios se encontraron en la epidermis adaxial.
Las hifas de Cercospora coffeicola se encontraron en la cámara subestomática como estructuras de rizo, y el parénquima de empalizada en la región de la lesión parece someterse a lisis de la pared celular. Evite el uso de pinzas, ya que pueden causar aplastamiento del tejido. Se deben realizar estudios histopatológicos adicionales sobre royas, antracnosis, cercosporiosis, smuts y otras interacciones planta-hongo biotróficas, hemibiotróficas y necrotróficas para investigar el uso potencial de esta técnica en diferentes patosistemas.
