Este protocolo es significativo porque permite la eliminación y sobreexpresión de los genes en un pez en desarrollo, y la cuantificación de esos efectos aguas abajo en las células sanguíneas. Este protocolo es rápido, fácil de realizar, económico y fácil de automatizar con acceso a la instrumentación adecuada. Demostrando este procedimiento estará Kristen Rueb, una investigadora de pregrado en el laboratorio.
Comience transfiriendo entre cinco y 200, 48 horas después de los embriones de fertilización a una placa de plástico petri de 10 centímetros. Incline el plato para que el embrión se hunda hasta el borde inferior, y retire tanto medio E3 del plato como sea posible. A continuación, añadir 500 microlitros de proteasa de deschorionación a los embriones.
Después de cinco minutos a temperatura ambiente, coloque todos los embriones en el borde inferior de la placa de nuevo y toque suavemente el lado del plato, permitiendo que los embriones se froten suavemente contra la parte inferior de la placa para quitar completamente sus corales. Con una botella de compresión añadir aproximadamente 20 mililitros de medio E3 para diluir la proteasa, y permitir que los embriones se asienten. A continuación, decantar el medio, y enjuagar los embriones tres veces más con medio fresco como se acaba de demostrar para eliminar todos los rastros de la proteasa.
Para preparar los embriones para la disociación, utilice una pipeta P1000 para transferir de cinco a 10 embriones en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros y aspire el medio E3 transferido. A continuación, añadir un mililitro de 10 mililitros de TDT en medio E3 al pez cebra embrionario, y colocar el tubo de microcentrífuga en una posición horizontal durante 30 minutos a temperatura ambiente para eliminar el recubrimiento de moco. Para la disociación de embriones, lave los embriones tratados con TDT tres veces con un mililitro de DPBS complementado con calcio y magnesio por lavado.
Antes de añadir 500 microlitros de DPBS complementados con calcio y magnesio, y cinco microlitros de cinco miligramos por mililitro, proteasa de disociación. Luego incuba las muestras a 37 grados Celsius en una coctelera orbital horizontal a 185 revoluciones por minuto durante 60 minutos. Asegúrese de revisar periódicamente los embriones, para que no los digiere en exceso.
Cuando se pueda observar una muestra no completamente homogénea con algún tejido sólido presente, triturar los embriones con una pipeta P1000 hasta que la muestra esté completamente disociada. Para preparar las células embrionarias de pez cebra disociadas para la citometría de flujo, transfiera toda la muestra celular al depósito superior de un tubo inferior redondo de poliestireno de cinco mililitros, con una tapa de colador celular de 35 micrómetros. Enjuague la tapa con cuatro mililitros de PBS sin calcio o magnesio, y pegue las células por centrifugación.
A continuación, resuspend las células en 500 microlitros de PBS sin calcio y magnesio por tubo. Para el análisis citométrico de flujo de las células embrionarias del pez cebra, vórtice suavemente las suspensiones celulares antes de agregar una dilución de uno a mil de la mancha de células muertas rojas a cada tubo. A los 30 minutos de aplicar la mancha de celda muerta, vacíe el tanque de residuos, llene el tanque de vaina con la solución adecuada e inicie el sistema fluido del cytómetro de flujo.
En el software de análisis, dibuje cinco trazados y establezca el primer trazado para medir hacia delante frente a la dispersión lateral. Establezca la dispersión hacia delante en lineal y el lado se dispersará a logarítmico. Establezca el segundo trazado para medir la altura de dispersión hacia delante frente al ancho de dispersión hacia delante, y el tercer trazado para medir la altura de dispersión frente al ancho de dispersión lateral.
Establezca el cuarto trazado para medir la mancha roja de la célula muerta en el eje X y la dispersión lateral en el eje y para permitir la discriminación de vivir de las células muertas. La quinta parcela debe fijarse para medir el fósforo de elección. Cuando se hayan establecido todas las gráficas, cargue la muestra en el citómetro y reduzca el caudal para que las celdas no se agoten rápidamente.
Ajuste los ajustes de dispersión hacia delante y hacia el lado para que la mayor parte de la población celular se pueda observar claramente y dibuje una puerta alrededor de la población celular. Etiquete las celdas de esta puerta. Con la segunda gráfica de puntos cerrada en las celdas, la puerta en la dispersión hacia adelante y los singletes de dispersión laterales para excluir los dobletes.
En la cuarta gráfica, ajuste la configuración de la mancha roja de la célula muerta para que haya una población claramente negativa. Dibuje una puerta alrededor de estas celdas y etiquete las celdas vivas de esta puerta. En el quinto trazado, puerta en las celdas vivas y dibujar una puerta alrededor de las celdas positivas, a continuación, ejecutar cada muestra recogiendo al menos 25.000 eventos de células vivas.
Cuando se hayan analizado todas las muestras, siga el procedimiento de apagado para apagar los fluidos, rellenar el depósito de vaciones y vaciar el depósito de residuos. Después de analizar el porcentaje de glóbulos rojos positivos de GFP de cada muestra embrionaria de pez cebra, se puede calcular el promedio de todo el grupo de control. Normalmente, el promedio se establece como uno y todos los porcentajes se calculan a partir de este punto de referencia.
En este análisis representativo, se determinó que la reducción de la transcripción del ISM1 con un morfolino específico, reduce el número de glóbulos rojos positivos de GFP presentes dentro de las 48 horas posteriores a los embriones de fertilización. Rescatar esta reducción en los niveles de morfolino ISM1 con ARNm exógeno, devolver el número de glóbulos rojos a la normalidad. La digestión adecuada en las muestras es fundamental.
Si digiere o infra-digiere, no obtendrá los resultados correctos. Si hay una máquina de fax disponible, los investigadores pueden recoger las células sanguíneas ordenando para cultivo in vitro, secuenciación de ARN y RT-PCR cuantitativo.
