Este protocolo proporciona un modelo robusto y reproducible de acumulación de sinucleina alfa en las neuronas de dopamina primaria para el estudio de los mecanismos y tratamientos que pueden regular esta acumulación. Este protocolo facilita un cribado de proteínas progresiva y altamente reproducible combinado con imágenes automatizadas y análisis de imágenes imparciales, que facilita un cribado relativamente rápido y de rendimiento medio de los camiones inhibidores de la acumulación de alfa-sinucleína. La acumulación progresiva de alfa-sinucleína puede ser uno de los factores que comprometen la función neuronal en la enfermedad de Parkinson y ciertos cuerpos nucleares.
Las nuevas moléculas que bloquean dicha acumulación pueden convertirse en nuevas terapias para la neuro degeneración. Creemos que este protocolo es un paso importante para establecer una herramienta estándar y confiable para estudiar los mecanismos moleculares que regulan la acumulación de alfa-sinucleína en las neuronas de dopamina. Demostrando el procedimiento estará Julia Konovalova, estudiante de doctorado de mi laboratorio.
Antes de configurar el cultivo celular embrionario primario de cerebro medio, añadir 50 microlitros de dopamina, el medio de neurona, a cada pocólite de la placa de poli-L-ornitina recubierta de 96 pozos y utilizar una punta de pipeta de 100 microlitros para aspirar el medio mientras que simultáneamente arañar la parte inferior de cada pozo en una dirección circular para eliminar el recubrimiento en el perímetro de cada pozo. Una isla recubierta de poli-L-ornitina permanecerá en el centro de cada pozo. Añadir 10 microlitros de medio al centro de cada isla recubierta para crear micro islas.
Establecer cultivos primarios embrionarios de cerebro medio a partir de embriones de ratón embrionarios embrionarios de ratón. Ata todos los pisos cosechados de cerebro medio en el mismo tubo de 1,5 mililitros y lava las muestras tres veces con 500 microlitros de HBSS sin calcio y magnesio por lavado. Después del último lavado reemplace el HBSS con 0.5%trypsin para una incubación de 30 minutos a 37 grados Celsius.
Al final de la incubación añadir 500 microlitros de una solución DNase I recién preparada en FBS al tejido parcialmente digerido y utilizar una pipeta de vidrio siliconizado con una punta pulida al fuego para triturar el tejido. Cuando sólo se pueden observar partículas pequeñas y apenas visibles, permiten que estos fragmentos de tejido se asienten en el fondo del tubo de micro centrífuga y transfieran este sobrenadante a un tubo de polipropileno cónico vacío de 15 mililitros. Añadir un mililitro de HBSS al tubo que contiene DNase I en FBS y mezclar varias veces por pipeteo.
Transfiera un mililitro de esta solución a las partículas de tejido restantes y vuelva a triturar las muestras. A continuación, tire de la suspensión celular digerida con el tubo de sobrenadante sin transferir los fragmentos de tejido restantes después de triturar la muestra de tejido una vez más con el resto de DNase I y FBS en sedimento HBSS las células recogidas por centrifugación y aspirar el sobrenadante sin alterar el pellet. Lavar las células dos veces en dos mililitros de medio de neurona de dopamina calentada por lavado.
Y resuspender las células a tres veces 10 a las células de fuerza por seis microlitros de concentración media y cálida fresca en un tubo de micro centrífuga. A continuación, retire el medio de cada micro isla previamente preparada y mezcle las células con pipeteo suave antes de usar una pipeta de 10 microlitros para agregar seis microlitros de células a cada micro isla. Cuando se hayan añadido todas las células, llene los pozos vacíos en los bordes de la placa con 150 microlitros de agua o PBS y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante una hora.
Al final de la incubación añadir 100 microlitros de neurona de dopamina fresca medio a cada pocóteo y devolver la placa a la incubadora. En el octavo día de cultivo celular en una campana de flujo laminar añadir a 3,75 microlitros de 100 microgramos por mililitro de fibrillas preformadas a cada pozo experimental, y 3,75 microlitros de PBS a cada pozo de control. Cuando trabaje con SLP tenga cuidado con la contaminación proteica no deseada y luego limpie la campana y todos los instrumentos asociados a PF con 1%SDS y 70%etanol.
En el punto final experimental adecuado después de la tinción para los marcadores de interés, cargue la placa de cultivo de 96 pozos en un escáner de placa de alto contenido equipado con un objetivo de 10 X. Ajuste los ajustes de acuerdo con las especificaciones de la placa de 96 pozos, como el tipo de juego, fabricante, tamaño, distancia entre los pozos, y el tipo y el volumen del medio. Seleccione el área de imagen de los pozos para cubrir todas las celdas de cada micro isla y utilice un pozo para ajustar el enfoque automático en la expresión DAPI.
Calibrar el tiempo de adquisición para cada canal fluorescente en función de la intensidad de la tinción en los pozos de control y ajustar los parámetros para que las células de dopamina en los pozos de control tratados con fibriedad preformado que albergan mosfosfoserina 129 agregados de sinucleína alfa dentro de la célula soma claramente se distingan permitiendo la cuantificación inequívoca de la fosfoserina 129 alfa sinucleina positiva y células negativas. A continuación, imagine todos los pozos seleccionados simultáneamente en todos los canales utilizando exactamente los mismos parámetros para cada pozo. Para el análisis de las imágenes, abra el analista de CellProfiler y seleccione el V2_THpos.
propiedades. Para ordenar las células segmentadas en fosfoserina 129 células positivas y negativas de sinucleína alfa, primero establezca el número de celdas de captura en 50 celdas aleatorias y haga clic en fetch para cargar imágenes de las celdas segmentadas. Arrastre al menos 30 celdas a la bandeja correspondiente en la parte inferior de la ventana.
seleccione utilizar impulso suave rápido con 50 reglas máximas o clasificadores de bosque al azar y haga clic en tren. Establecer fetch en 50 celdas positivas y haga clic en fetch para adquirir ejemplo de fosfoserina positiva 129 células de sinucleína alfa puntuadas según el clasificador de tren o establecer fetch en 50 celdas negativas y haga clic en fetch para adquirir ejemplo de fosfoserina negativa 129 células de sinucleína alfa según el clasificador de tren. Cuando los resultados son satisfactorios, haga clic en puntuación todos para generar una tabla de resultados que resume el número de fosfoserina 129 alfa sinucleína positiva y negativa neuronas de dopamina en cada pozo.
Unos días después del enchapado se puede observar un cultivo de propagación homogénea mediante microscopía de luz dentro de la micro isla creada antes del revestimiento. Las neuronas primarias se asientan en el fondo de la placa recubierta de forma homogénea y establecen proyecciones neuronales. En esta imagen, se puede observar un pequeño grupo de células de menos de 150 micrometros de diámetro.
La tinción inmuno de control de los cultivos primarios del cerebro del ratón no tratados con marcadores celulares neuronales 15 días después del enchapado revela un apego restringido de las células dentro de las micro islas en el medio de los pozos de la placa. Neuronas de dopamina inmuno etiquetado con tirosina hidroxilasa marcador extendido alrededor de la micro isla en una monocapa separada entre sí sin ningún aglutinamiento. En cultivos tratados con fibrilla preformada de alfa-sinucleína, también se pueden observar inclusiones positivas de sinucleína alfa pS129.
El tratamiento con fibrillas preformadas in vitro durante siete días no causa una disminución significativa en el número de neuronas positivas de tirosina hidroxilasa positivas en comparación con otros grupos experimentales. El tratamiento con factor neurotrófico derivado de la línea celular glial sin embargo, reduce el porcentaje de pS129 alfa-sinucleína inclusión positiva, albergando neusinas de dopamina positivas de tirosina hidroxilasa. Antes de crear micro islas, asegúrese de que los pozos recubiertos con poli-l ornitina estén sólidamente lavados.
También asegúrese de utilizar medios frescos al enchapar nuevos cultivos cerebrales. El método se puede combinar con la edición de genes y los inhibidores farmacológicos para estudiar los efectos de genes específicos y ondas de pensamiento en la agregación de nucleones. Usamos rutinariamente este método para detectar nuevas moléculas que inhibe la acumulación de sinucleína alfa.
Han demostrado los efectos protegidos por acumulación de TDN y actualmente analizando varias moléculas candidatas pequeñas.
