Questo protocollo fornisce un modello robusto e riproducibile di accumulo di alfa sinuleina nei neuroni della dopamina primaria per studiare i meccanismi e i trattamenti che possono regolare questo accumulo. Le fibrille alfa-sinuleina preformate inducono un accumulo progressivo e altamente riproducibile di proteine combinato con l'imaging automatizzato e l'analisi imparziale delle immagini, questo protocollo facilita uno screening della produttività relativamente veloce, medio-alto dei camion inibitori dell'accumulo di alfa-sinuleina. L'accumulo progressivo di alfa-sinuleina può essere uno dei fattori che compromettono la funzione neuronale nel morbo di Parkinson e in alcuni corpi nucleari.
Nuove molecole che bloccano tale accumulo possono diventare nuove terapie per la neurodegenerazione. Crediamo che questo protocollo sia un passo importante per stabilire uno strumento standard e affidabile per studiare i meccanismi molecolari che regolano l'accumulo di alfa-sinuleina nei neuroni della dopamina. A dimostrare la procedura sarà Julia Konovalova, dottoranda del mio laboratorio.
Prima di impostare la coltura primaria delle cellule del mesencefalo embrionale, aggiungere 50 microlitri di dopamina, il mezzo neuronale, ad ogni pozzo della piastra del pozzo rivestita in Poli-L-Ornitina 96 e utilizzare una punta di pipetta da 100 microlitri per aspirare il mezzo graffiando contemporaneamente il fondo di ogni pozzo in una direzione circolare per rimuovere il rivestimento sul perimetro di ogni pozzo. Un'isola rivestita in Poli-L-Ornitina rimarrà al centro di ogni pozzo. Aggiungere 10 microlitri di mezzo al centro di ogni isola rivestita per creare micro isole.
Creare colture primarie di midbrain embrionali dal giorno embrionale del topo 13,5 embrioni di topo. Mettere in comune tutti i pavimenti a metàbrain raccolti nello stesso tubo da 1,5 millilitri e lavare i campioni tre volte con 500 microlitri di HBSS senza calcio e magnesio per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio sostituire l'HBSS con 0,5% di tripside per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius.
Al termine dell'incubazione aggiungere 500 microlitri di una soluzione DNasi I in FBS appena preparata al tessuto parzialmente digerito e utilizzare una pipetta di vetro siliconizzata con punta lucidata a fuoco per triturare il tessuto. Quando si possono osservare solo particelle minuscole e appena visibili, questi frammenti di tessuto si depositano sul fondo del tubo di micro centrifuga e trasferiscono questo supernatante in un tubo di polipropilene conico vuoto da 15 millilitri. Aggiungere un millilitro di HBSS al tubo contenente DNasi I in FBS e mescolare più volte con pipettazione.
Trasferire un millilitro di questa soluzione alle particelle di tessuto rimanenti e triturare nuovamente i campioni. Quindi tirare la sospensione cellulare digerita con il tubo di supernatante senza trasferire frammenti di tessuto rimanenti dopo aver triturato il campione di tessuto ancora una volta con la DNasi I e FBS rimanente nei sedimenti HBSS le cellule raccolte per centrifugazione e aspirare il supernatante senza disturbare il pellet. Lavare le cellule due volte in due millilitri di mezzo neurone dopamina riscaldato per lavaggio.
E rimospendare le cellule a un tre per 10 alle cellule di forza per sei microlitri di concentrazione calda e media fresca in un tubo di micro centrifuga. Quindi rimuovere il mezzo da ogni micro isola preparata in precedenza e mescolare le cellule con una pipetta delicata prima di utilizzare una pipetta da 10 microlitri per aggiungere sei microlitri di cellule a ogni micro isola. Una volta aggiunte tutte le celle, riempire i pozzi vuoti ai bordi della piastra con 150 microlitri di acqua o PBS e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per un'ora.
Alla fine dell'incubazione aggiungere 100 microlitri di mezzo neurone dopamina fresco ad ogni pozzo e restituire la piastra all'incubatore. L'ottavo giorno di coltura cellulare in una cappa di flusso laminare aggiungere a 3,75 microlitri di 100 microgrammi per millilitro di fibrille preformate ad ogni pozzo sperimentale e 3,75 microlitri di PBS ad ogni pozzo di controllo. Quando si lavora con PFS, essere cauti sulla contaminazione proteica indesiderata e successivamente pulire la cappa e tutti gli strumenti associati al PF con 1%SDS e 70% di etanolo.
All'endpoint sperimentale appropriato dopo la colorazione per i marcatori di interesse, caricare la piastra di coltura del pozzo 96 su uno scanner a piastre ad alto contenuto dotato di un obiettivo 10 X. Regolare le impostazioni in base alle specifiche della piastra del pozzo 96 come il tipo di gioco, il produttore, le dimensioni, la distanza tra i pozzi e il tipo e il volume del mezzo. Selezionare l'area di imaging dei pozzi per coprire tutte le celle di ogni micro isola e usarne una nota per regolare la messa a fuoco automatica sull'espressione DAPI.
Calibrare il tempo di acquisizione per ogni canale fluorescente in base all'intensità della colorazione nei pozzi di controllo e regolare i parametri in modo che le cellule della dopamina nei pozzi di controllo preformati trattati con fibrillazione che ospitano gli aggregati di fosfoserina 129 alfa sinucleina all'interno del soma cellulare si distinguano chiaramente consentendo una quantificazione inequivocabile delle cellule positive e negative della fosfoserina 129 alfa sinucleina. Quindi immagine di tutti i pozzi selezionati contemporaneamente in tutti i canali utilizzando esattamente gli stessi parametri per ogni pozzo. Per l'analisi delle immagini, aprire l'analista di CellProfiler e selezionare la V2_THpos.
proprietà. Per ordinare le celle segmentate in fosfossina 129 cellule positive e negative alfa sinucleina impostare innanzitutto il numero di celle di recupero su 50 celle casuali e fare clic su recupera per caricare le immagini delle celle segmentate. Trascinare almeno 30 celle nella collocazione corrispondente nella parte inferiore della finestra.
selezionare utilizzare un potenziamento rapido e delicato con 50 regole max o classificatori di foresta casuali e fare clic su addestra. Impostare fetch su 50 celle positive e fare clic su fetch per acquisire celle di fosfoserina alfa alfa 129 positive di esempio valutate in base al classificatore del treno o impostare fetch su 50 celle negative e fare clic su fetch per acquisire celle di fosfoserina alfa 129 alfa 129 di esempio in base al classificatore del treno. Quando i risultati sono soddisfacenti, fare clic su tutto per generare una tabella dei risultati che riassume il numero di neuroni della dopamina alfa sinucleina alfa sinucleina positivi e negativi in ogni pozzo.
Pochi giorni dopo aver placcato una coltura distribuita in modo omogeneo può essere osservata mediante microscopia ottica all'interno della micro isola creata prima della placcatura. I neuroni primari si depositano sul fondo della piastra rivestita in modo omogeneo e stabiliscono proiezioni neuronali. In questa immagine, si può osservare un piccolo ciuffo di cellule di diametro inferiore a 150 micrometri.
La colorazione immuno del controllo delle colture primarie di topo non trattate del cervello medio con marcatori cellulari neuronali 15 giorni dopo la placcatura rivela un attaccamento limitato delle cellule all'interno delle micro isole al centro dei pozzi della piastra. Neuroni della dopamina immuno etichettati con marcatore di tirosina idrossilasi sparsi intorno alla micro isola in un monostrato separato l'uno dall'altro senza alcun raggruppamento. Nelle colture trattate con fibrillazione preformata alfa-sinucolaina, si possono anche osservare inclusioni positive di alfa sinuleina pS129.
Il trattamento con fibrille preformate in vitro per sette giorni non causa una significativa diminuzione dei numeri positivi di neuroni tirosina idrossilasi rispetto ad altri gruppi sperimentali. Il trattamento con fattore neurotrofico derivato dalla linea cellulare gliale, tuttavia, riduce la percentuale di inclusione positiva di pS129 alfa-sinuleina, ospitando neuroni della dopamina positivi all'idrossilasi tirosina. Prima di creare micro isole, assicurarsi che i pozzali rivestiti in ornitina Poly-L siano saldamente lavati.
Assicurati anche di usare nuovi media quando placca nuove culture cerebrali. Il metodo può essere combinato con l'editing genico e gli inibitori farmacologici per studiare gli effetti di specifici geni e onde di pensiero sull'aggregazione del nucleone. Usiamo regolarmente questo metodo per cercare nuove molecole che inibiscono l'accumulo di alfa sinuleina.
Hanno dimostrato gli effetti protetti dall'accumulo di TDN e attualmente analizzando diverse piccole molecole candidate.
