このプロトコルは、この蓄積を調節する可能性のあるメカニズムと治療を研究するための一次ドーパミンニューロンにおけるアルファシヌクレイン蓄積の堅牢で再現可能なモデルを提供します。α-シヌクレインフィブリルは、進行性で再現性の高いタンパク質蓄積を、自動画像化および偏りのない画像解析と組み合わせて誘導し、このプロトコルは、α-シヌクレイン蓄積を阻害するトラックの比較的高速で、中~高スループットのスクリーニングを促進する。進行性α-シヌクレイン蓄積は、パーキンソン病および特定の核体における神経機能を損なう要因の1つである可能性がある。
このような蓄積を遮断する新しい分子は、神経変性の新しい治療法になる可能性があります。このプロトコルは、ドーパミンニューロンにおけるα-シヌクレイン蓄積を調節する分子メカニズムを研究するための標準かつ信頼性の高いツールを確立するための重要なステップであると考えています。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程の学生、ジュリア・コノヴァワです。
一次胚性中脳細胞培養を設定する前に、50マイクロリットルのドーパミン、ニューロン培地をポリ-L-オルニチンコーティング96ウェルプレートの各ウェルに加え、100マイクロリットルのピペットチップを使用して培地を吸引し、各ウェルの底部を円形方向に掻き取り、各ウェルの周囲のコーティングを除去する。ポリ-L-オルニチンコーティングされた島は、各井戸の真ん中に残ります。各コーティングされた島の真ん中に10マイクロリットルの媒体を加え、マイクロアイランドを作ります。
マウス胚性13.5日目のマウス胚から原発性胚性中脳培養を設定する。収穫した中脳床のすべてを同じ1.5ミリリットルのチューブにプールし、1回の洗浄ごとに500マイクロリットルのカルシウムとマグネシウムフリーHBSSでサンプルを3回洗浄します。最後の洗浄後、HBSSを0.5%トリプシンに置き換え、摂氏37度で30分間インキュベーションします。
インキュベーションの最後に、FBS溶液中の新たに調製したDNase Iの500マイクロリットルを部分的に消化した組織に加え、火で研磨された先端を備えたシリコン化ガラスピペットを使用して組織をトリチュレートします。小さな、かろうじて目に見える粒子しか観察できない場合、これらの組織断片はマイクロ遠心チューブの底に落ち着き、この上清を空の15ミリリットルの円錐型ポリプロピレンチューブに移すことができます。DNase Iを含むチューブにHBSSを1ミリリットル加え、ピペットで数回混ぜます。
この溶液の1ミリリットルを残りの組織粒子に移し、サンプルを再び三分化する。次に、残りのDNase IとFBSをHBSS沈降液中の残りのDNase IおよびFBSでもう一度トリチュールした後、残りの組織断片を移さずに上清のチューブで消化した細胞懸濁液を引き出し、ペレットを乱すことなく上清を遠心して吸引する。1回の洗浄で温めたドーパミンニューロン培地の2ミリリットルで細胞を2回洗浄します。
そして、マイクロ遠心チューブ中の新鮮な暖かい、中濃度の6マイクロリットル当たりの力細胞に3倍10で細胞を再懸濁する。次に、以前に調製した各マイクロアイランドから培地を取り除き、10マイクロリットルのピペットを使用して各マイクロアイランドに6マイクロリットルの細胞を追加する前に、穏やかなピペットで細胞を混合します。すべての細胞を添加したら、プレートの端にある空の井戸を150マイクロリットルの水またはPBSで満たし、プレートを細胞培養インキュベーターに1時間置きます。
インキュベーションの終わりに各ウェルに新鮮なドーパミンニューロン培地の100マイクロリットルを追加し、インキュベーターにプレートを返します。ラミナーフローフードの8日目の細胞培養は、各実験井戸にプリフォームされたフィブリルの1ミリリットル当たり100マイクログラムの3.75マイクロリットルで、各制御ウェルにPBSの3.75マイクロリットルを加える。PFSで作業する場合は、不要なタンパク質汚染に注意し、その後、フードと1%SDSと70%エタノールとすべてのPF関連機器を清掃してください。
目的のマーカーを染色した後、適切な実験エンドポイントで、96ウェル培養プレートを10 Xの目的を取り付けた高コンテンツプレートスキャナにロードします。96ウェルプレートの仕様に応じて、プレイタイプ、メーカー、サイズ、ウェル間の距離、メディアの種類とボリュームに合わせて設定を調整します。各マイクロアイランド内のすべての細胞をカバーするウェルのイメージング領域を選択し、1つのウェルを使用してDAPI式の自動フォーカスを調整します。
コントロールウェル内の染色の強度に基づいて各蛍光チャネルの取得時間を較正し、細胞相腫内のホスホセリン129αシヌクレイン凝集体を収容する予知型フィブリル処理制御井戸内のドーパミン細胞が明確に区別されるようにパラメータを調整し、ホスホセリン129αsinと陽性細胞の明確な定量を可能にする。次に、選択したすべてのウェルを、各ウェルに対してまったく同じパラメータを使用して、すべてのチャンネルで同時に画像を作成します。画像の分析のために、CellProfiler アナリストを開き、V2_THposを選択します。
プロパティ ファイル。セグメント化されたセルをホスホセリン 129 アルファシヌクレイン陽性セルと負のセルにソートするには、まずフェッチセルの数を 50 個のランダムセルに設定し、クリックして [取得] をクリックしてセグメント化されたセルの画像を読み込みます。ウィンドウの下部にある対応するビンに、少なくとも 30 個のセルをドラッグします。
50の最大ルールまたはランダムな森林分類器で高速穏やかなブーストを使用して選択し、列車をクリックします。50個の陽性細胞にフェッチを設定し、クリックフェッチを行い、列車の分類器に従ってスコア付けされた陽性ホスホセリン129αシヌクレイン細胞の例を取得するか、50個の負の細胞にフェッチを設定し、クリックして、列車分類器に従って例えば陰性ホスホセリン129αシヌクレイン細胞を取得する。結果が満足のいく場合は、スコアをすべてクリックして、各ウェルの129ααシヌクレイン陽性および陰性ドーパミンニューロンの数を要約した結果表を生成する。
めっき後数日後に均一に広がった培養物は、めっき前に作られたマイクロアイランド内の光顕微鏡観察により観察することができる。一次ニューロンは、均一にコーティングされたプレート底面に落ち着き、ニューロンの突起を確立します。この画像では、直径150マイクロメートル未満の細胞の小さな塊が観察される。
めっきの15日後に神経細胞マーカーを用いたコントロール無処置の一次マウス中脳培養の免疫染色は、プレートウェルの真ん中にあるマイクロアイランド内の細胞の結合が制限されていることが明らかとなる。チロシンヒドロキシラーゼマーカーで標識されたドーパミンニューロンは、塊を使わずに互いに分離された単層でマイクロアイランドの周りに広がる。α-シヌクレインは、前形フィブリル処理培養物において、αシヌクレイン陽性包接物も観察できる。
7日間のin vitroの前形のフィブリルによる治療は、他の実験基と比較してチロシンヒドロキシラーゼ陽性ニューロン数の有意な減少を引き起こさない。しかし、グリア細胞株由来神経栄養因子による治療は、pS129α-シヌクレイン陽性包含の割合を減少させ、チロシンヒドロキシラーゼ陽性ドーパミンニューロンを収容する。マイクロアイランドを作成する前に、ポリ-Lオルニチンコーティングされた井戸がしっかりと洗浄されていることを確認してください。
また、新しい脳培養物をめっきする際には、新鮮なメディアを使用してください。この方法は、遺伝子編集および薬理学的阻害剤と組み合わせて、特定の遺伝子および思考波が核オン凝集に及ぼす影響を研究することができる。この方法を使用して、αシヌクレイン蓄積を阻害する新しい分子をスクリーニングしています。
TDNの蓄積保護効果を実証し、現在いくつかの小さな候補分子を分析しています。
