Этот протокол обеспечивает надежную, воспроизводимую модель накопления альфа-синуклеина в первичных нейронах допамина для изучения механизмов и методов лечения, которые могут регулировать это накопление. Преформированные фибриллы альфа-синуклеина вызывают прогрессивное, высоковоспроизводимое накопление белка в сочетании с автоматизированной визуализацией и беспристрастным анализом изображений, этот протокол облегчает относительно быстрый, средний и высокий пропускной скрининг накопления альфа-синуклеина, ингибирующего грузовики. Прогрессивное накопление альфа-синуклеина может быть одним из факторов, компрометирующих функцию нейронов при болезни Паркинсона и некоторых ядерных органах.
Новые молекулы, блокирующие такое накопление, могут стать новыми методами лечения нейродегенерации. Мы считаем, что этот протокол является важным шагом для создания стандартного и надежного инструмента для изучения молекулярных механизмов, регулирующих накопление альфа-синуклеина в нейронах допамина. Демонстрацией процедуры будет юлия Коновалова, аспирантка моей лаборатории.
Перед созданием первичной эмбриональной культуры клеток среднего мозга, добавить 50 микролитров допамина, нейрон среды, к каждому колодец Поли-L-Орнитин покрытием 96 хорошо пластины и использовать 100 микролитер пипетки наконечник аспирировать среды в то же время царапин нижней части каждого хорошо в круговом направлении, чтобы удалить покрытие по периметру каждой хорошо. Поли-L-Орнитин покрытием остров останется в середине каждого хорошо. Добавьте 10 микролитров среднего и среднего к середине каждого острова с покрытием, чтобы создать микро острова.
Для настройки первичных эмбриональных культур среднего браина из эмбрионального дня мыши 13,5 эмбрионов мыши. Бассейн все собранные полы среднего дюйма в той же 1,5 миллилитров трубки и мыть образцы три раза с 500 микролитров кальция и магния бесплатно HBSS за стирку. После последней стирки замените HBSS на 0,5% трипсина в течение 30 минут инкубации при 37 градусах по Цельсию.
В конце инкубации добавьте 500 микролитров свежеприготовленного DNase I в раствор FBS в частично переваренную ткань и используйте силиконовую стеклянную пипетку с огнем полированной наконечником для тритурации ткани. Когда только крошечные, едва видимые частицы могут наблюдаться позволяют этим фрагментам ткани осесть на дно микроцентрифуги трубки и передать этот супернатант в пустой 15 миллилитров конической полипропиленовой трубки. Добавьте один миллилитр HBSS в трубку, содержащую DNase I в FBS, и несколько раз перемешайте с помощью труб.
Перенесите один миллилитр этого раствора на оставшиеся частицы ткани и снова тритуративе образцов. Затем потяните переваренную клеточную суспензию с трубкой супернатанта, не передавая оставшиеся фрагменты тканей после тритурации образца ткани еще раз с оставшимися DNase I и FBS в отложениях HBSS собранные клетки центрифугации и аспирировать супернатант, не нарушая гранулы. Вымойте клетки два раза в двух миллилитров нагревается допамина нейрона среды на стирку.
И повторного перерасхода клеток в три раза 10 к силу клеток на шесть микролитров свежей теплой, средней концентрации в микро центрифуге трубки. Затем удалите среду с каждого ранее подготовленного микро-острова и смешайте клетки с нежным пипеткой перед использованием 10 микролитровой пипетки, чтобы добавить шесть микролитров клеток к каждому микро островку. Когда все клетки были добавлены, заполнить пустые колодцы по краям пластины с 150 микролитров воды или PBS и поместить пластину в инкубатор культуры клеток в течение одного часа.
В конце инкубации добавить 100 микролитров свежего допамина нейронов среды к каждому хорошо и вернуть пластину в инкубатор. На восьмой день клеточной культуры в ламинарном потоке капот добавляют по 3,75 микролитера по 100 микрограмм на миллилитр предварительно сформированных фибрилляций к каждой экспериментальной колодец и 3,75 микролитров PBS к каждой контрольной хорошо. При работе с PFS будьте осторожны с нежелательным загрязнением белка, а затем очистить капот и все PF связанных инструментов с 1%SDS и 70% этанола.
На соответствующей экспериментальной конечной точке после окрашивания для маркеров интереса, загрузить 96 хорошо культуры пластины на высокое содержание пластины сканер оснащен 10 X цели. Отрегулируйте настройки в соответствии со спецификациями пластины 96 скважин, таких как тип игры, производитель, размер, расстояние между скважинами, а также тип и объем среды. Выберите область изображения скважин, чтобы охватить все ячейки на каждом микро-острове и используйте одну скважину, чтобы настроить автоматическое внимание к выражению DAPI.
Калибруйте время приобретения для каждого флуоресцентного канала на основе интенсивности окрашивания в контрольных скважинах и отрегулируйте параметры таким образом, чтобы клетки допамина в предварительно сформированной фибрили лечили контрольные скважины, укрывляющие фосфосфозерин 129 альфа-синуклеин агрегатов в клеточной соме, четко отличающихся однозначной количественной оценкой фосфосерин 129 альфа-синуклеина и отрицательных клеток. Затем изображение всех выбранных скважин одновременно во всех каналах, используя точно такие же параметры для каждой скважины. Для анализа изображений откройте аналитика CellProfiler и выберите V2_THpos.
файл свойств. Чтобы сортировать сегментированные клетки в фосфосерин 129 альфа-синуклеин положительных и отрицательных клеток сначала установить количество клеток извлечения до 50 случайных клеток и нажмите принести для загрузки изображений сегментированных клеток. Перетащите не менее 30 ячеек в соответствующую ячейку в нижней части окна.
выберите быстрое мягкое повышение с 50 максимальными правилами или случайными классификаторами леса и нажмите поезд. Установите принести до 50 положительных клеток и нажмите принести, чтобы приобрести пример положительный фосфосерин 129 альфа-синуклеин клетки забил в соответствии с классификатором поезда или установить принести до 50 отрицательных клеток и нажмите принести приобрести пример отрицательных фосфосерин 129 альфа-синуклеин клеток в соответствии с классификатором поезда. Когда результаты являются удовлетворительными, нажмите оценка все для создания таблицы результатов суммирования числа фосфосерин 129 альфа-синуклеин положительных и отрицательных нейронов допамина в каждой хорошо.
Через несколько дней после покрытия однородной культуры распространения можно наблюдать с помощью световой микроскопии в микро-остров, созданный до покрытия. Первичные нейроны оседают на покрытом дном пластины однородно и устанавливают нейронные проекции. На этом снимке можно наблюдать небольшой скопление клеток диаметром менее 150 микрометров.
Иммуно окрашивание контроля необработанных первичных культур мыши среднего мозга с маркерами нейронных клеток через 15 дней после покрытия показывает ограниченное вложение клеток в микро островов в середине пластины скважин. Допамин нейронов иммуно помечены тирозин гидроксилазы маркер распространился по всему микро острова в монослой отделены друг от друга без каких-либо слипания. В альфа-синуклеин предварительной фибрилляции обработанных культур, pS129 альфа синуклеин положительные включения также могут наблюдаться.
Лечение в пробирке преформированных фибрилл в течение семи дней не вызывает значительного снижения числа тирозин гидроксилазы положительных нейронов по сравнению с другими экспериментальными группами. Лечение с glial клеточной линии, полученных нейротрофический фактор однако, снижает процент pS129 альфа-синуклеин положительное включение, укрывательство гидроксилазы тирозина положительные нейроны допамина. Прежде чем создавать микро-островов, убедитесь, что Поли-L орнитин покрытием скважин прочно промывают.
Также не забудьте использовать свежие средства массовой информации при облицовке новых культур мозга. Метод можно сочетать с редактированием генов и фармакологическими ингибиторами для изучения влияния специфических генов и волны мысли на агрегацию нуклеона. Мы регулярно используем этот метод для проверки новых молекул, которые препятствуют накоплению альфа-синуклеина.
Продемонстрировали накопление защищенных эффектов TDN и в настоящее время анализ нескольких небольших молекул кандидата.
