Bu protokol, bu birikimi düzenleyebilecek mekanizmalar ve tedavilerin incelenmesi için primer dopamin nöronlarında alfa sinüklein birikiminin sağlam, tekrarlanabilir bir modelini sağlar. Önceden biçimlendirilmiş alfa-sinüklein fibriller progresif, yüksek tekrarlanabilir protein birikimini otomatik görüntüleme ve tarafsız görüntü analizi ile birlikte indükler, bu protokol alfa-sinüklein birikimiin inhibe kamyonnispeten hızlı, orta ve yüksek verimli tarama kolaylaştırır. Progresif alfa-sinüklein birikimi Parkinson hastalığı ve bazı nükleer cisimlerde nöronal fonksiyonu tehlikeye faktörlerden biri olabilir.
Bu birikimi engelleyen yeni moleküller nöro dejenerasyon için yeni tedaviler haline gelebilir. Bu protokolün, Dopamin nöronlarında alfa-sinüklein birikimini düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için standart ve güvenilir bir araç oluşturmak için önemli bir adım olduğuna inanıyoruz. Prosedürü gösteren Julia Konovalova, benim laboratuvarımdan doktora öğrencisi olacak.
Birincil embriyonik orta beyin hücre kültürünü kurmadan önce, dopamin 50 mikrolitre ekleyin, nöron orta, Poly-L-Ornithine kaplı her kuyuya 96 iyi plaka ve aynı anda her kuyunun alt çizik ise orta aspire etmek için 100 mikrolitrelik pipet ucu kullanın her kuyunun çevresinde kaplama kaldırmak için dairesel bir yönde. Bir Poli-L-Ornithine kaplı ada her kuyunun ortasında kalacaktır. Mikro adalar oluşturmak için her kaplamalı adanın ortasına orta 10 mikrolitre ekleyin.
Fare embriyonik gün 13.5 fare embriyolarından birincil embriyonik orta beyin kültürleri kurmak için. Hasat edilen orta beyin zeminlerinin hepsini aynı 1,5 mililitrelik tüpe toplayın ve numuneleri yıkama başına 500 mikrolitre kalsiyum ve magnezyumsuz HBSS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra 37 santigrat derecede 30 dakikalık bir kuluçka için HBSS'yi %0,5 tripsin ile değiştirin.
Kuluçka sonunda kısmen sindirilmiş doku fbs çözeltisi yeni hazırlanmış DNase I 500 mikrolitre ekleyin ve doku triturate için bir yangın cilalı ucu ile silikonlu cam pipet kullanın. Sadece küçük, zar zor görülebilen parçacıklar bu doku parçalarının mikro santrifüj tüpünün dibine yerleşmesine ve bu süpernatantı boş bir 15 mililitrelik konik polipropilen tüpe aktarmasını sağlar. FBS'de DNase I içeren tüpe bir mililitre HBSS ekleyin ve pipetleme ile birkaç kez karıştırın.
Bu çözeltinin bir mililitresini kalan doku parçacıklarına aktarın ve örnekleri tekrar triturate edin. Daha sonra kalan DNase I ve HBSS'deki FBS ile doku örneğini bir kez daha triturating sonra kalan doku parçaları aktarmadan supernatant tüpü ile sindirilmiş hücre süspansiyon çekin santrifüj ile toplanan hücreleri ve pelet rahatsız etmeden supernatant aspire. Yıkama başına ısıtılmış dopamin nöron orta iki mililitre hücreleri iki kez yıkayın.
Ve hücreleri üç kez 10'da, mikro santrifüj tüpte altı mikrolitre lik taze sıcak, orta konsantrasyondaki kuvvet hücrelerine geri uzaklaştırın. Daha sonra her daha önce hazırlanmış mikro adadan orta çıkarın ve her mikro adaya hücrelerin altı mikrolitre eklemek için 10 mikrolitre pipet kullanmadan önce nazik pipetleme ile hücreleri karıştırın. Tüm hücreler eklendiğinde, plakanın kenarlarındaki boş kuyuları 150 mikrolitre su veya PBS ile doldurun ve plakayı bir saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.
Kuluçka sonunda her kuyuya taze dopamin nöron orta 100 mikrolitre ekleyin ve kuvöz plaka dönmek. Bir laminar akış kaputunda hücre kültürünün sekizinci gününde her deneysel kuyuya mililitre başına 100 mikrogram lık 3.75 mikrolitre ve her bir kontrol kuyusu için 3.75 mikrolitre PBS ekleyin. PFS ile çalışırken istenmeyen protein kontaminasyonu konusunda dikkatli olun ve daha sonra kaputu ve PF ile ilişkili tüm aletleri %1 SDS ve %70 etanol ile temizleyin.
İlgi işaretleri için boyama sonra uygun deneysel bitiş noktasında, 10 X hedefi ile donatılmış yüksek içerik plaka tarayıcı üzerine 96 kuyu kültür plakası yükleyin. Ayarları, oyun türü, üretici, boyut, kuyular arasındaki mesafe ve ortamın türü ve hacmi gibi 96 kuyu plakasının özelliklerine göre ayarlayın. Her mikro adadaki tüm hücreleri kapsayacak şekilde kuyuların görüntüleme alanını seçin ve DAPI ifadesine otomatik odaklanmayı ayarlamak için bir kuyu kullanın.
Kontrol kuyularında boyama yoğunluğuna göre her floresan kanal için edinme süresini kalibre edin ve önceden bilgili fibril tedavi kontrol kuyularında dopamin hücreleri fosfoserin 129 alfa sinüklein agregaları hücre soma içinde barındıran açıkça ayırt edilebilir böylece parametreleri ayarlamak fosfoserin 129 alfa synüklein pozitif ve negatif hücrelerin kesin bir nicelik sağlar. Daha sonra seçilen kuyuların tümünün her kuyu için tam olarak aynı parametreleri kullanarak tüm kanallarda aynı anda görüntülenin. Görüntülerin analizi için CellProfiler analistini açın ve V2_THpos seçin.
özellikleri dosya. Segmente edilmiş hücreleri fosfoserin 129 alfa sinüklein pozitif ve negatif hücrelere ayırmak için önce hücre sayısını 50 rasgele hücreye ayarlayın ve segmente edilmiş hücrelerin görüntülerini yüklemek için getir'i tıklatın. En az 30 hücreyi pencerenin altındaki ilgili kutuya sürükleyin.
50 max kuralları veya rasgele orman sınıflandırıcılar ile hızlı nazik artırma kullanın seçin ve tren tıklayın. 50 pozitif hücreye getirin ve tren sınıflayıcısına göre puanlanan örnek pozitif fosfoserin 129 alfa sinüklein hücreleri elde etmek için getir'i tıklatın veya 50 negatif hücreye getir'i ayarlayın ve tren sınıflayıcısına göre örnek negatif fosfoserin 129 alfa sinüklein hücreleri elde etmek için getir'e tıklayın. Sonuçlar tatmin edici olduğunda, her kuyudaki fosfoserin 129 alfa sinüklein pozitif ve negatif dopamin nöronlarının sayısını özetleyen bir sonuç tablosu oluşturmak için tüm skora tıklayın.
Kaplamadan birkaç gün sonra homojen bir şekilde yayılan bir kültür, kaplamadan önce oluşturulan mikro adadaki ışık mikroskobu ile gözlemlenebilir. Primer nöronlar kaplamalı plaka alt homojen yerleşmek ve nöronal projeksiyonlar kurmak. Bu resimde çapı 150 mikro metreden küçük bir hücre yığını gözlemlenebilir.
Kontrol tedavi edilmeyen birincil fare nin immünboy boyanması nöronal hücre belirteçleri ile 15 gün sonra plaka kuyularının ortasında ki mikro adalar içindeki hücrelerin sınırlı bir eki ortaya çıkarır. Tirozin hidroksilaz belirteci ile etiketlenmiş dopamin nöronlar immün otoplin, mikro ada çevresinde bir monolayer halinde yayılır. Alfa-sinüklein önceden bürünen fibril tedavi edilen kültürlerde pS129 alfa sinüklein pozitif inklütleri de görülebilir.
Yedi gün boyunca in vitro preformafibriller ile tedavi diğer deneysel gruplara göre tirozin hidroksilaz pozitif nöron sayılarında önemli bir azalmaya neden olmaz. Glial hücre hattı ile tedavi ancak, pS129 alfa-sinüklein pozitif dahil yüzdesini azaltır, tirozin hidroksilaz pozitif dopamin nöronlar barındıran. Mikro adalar oluşturmadan önce, Poly-L ornitin kaplı kuyuların sağlam bir şekilde yıkandığından emin olun.
Ayrıca yeni beyin kültürleri kaplama zaman taze medya kullandığınızdan emin olun. Bu yöntem, gen düzenleme ve farmakolojik inhibitörleri ile birleştirilip belirli genlerin ve düşünce dalgalarının nükleon agregasyonu üzerindeki etkilerini inceleyebilir. Alfa sinüklein birikimini engelleyen yeni molekülleri taramak için rutin olarak bu yöntemi kullanıyoruz.
TDN birikimi korumalı etkilerini göstermiştir ve şu anda birkaç küçük aday molekülleri analiz.
