פרוטוקול זה מספק מודל חזק, לשחזור של הצטברות אלפא סינוקליין נוירונים דופמין ראשוני לחקר המנגנונים והטיפולים שעשויים לווסת הצטברות זו. פיברילים אלפא-סינוקליין מעוצבים מראש גורמים להצטברות חלבונים מתקדמת ומשוחזרת מאוד בשילוב עם הדמיה אוטומטית וניתוח תמונה לא משוחד, פרוטוקול זה מאפשר סינון תפוקה מהיר יחסית, בינוני עד גבוה של הצטברות אלפא-סינוקליין המעכבת משאיות. הצטברות אלפא-סינוקליין מתקדמת עשויה להיות אחד הגורמים להתפשר על תפקוד עצבי במחלת פרקינסון וגופים גרעיניים מסוימים.
מולקולות חדשות החוסמות הצטברות כזו עשויות להפוך לטיפולים חדשים לניוון עצבי. אנו מאמינים כי פרוטוקול זה הוא צעד חשוב להקמת כלי סטנדרטי ואמין ללמוד מנגנונים מולקולריים המסדירים הצטברות אלפא-סינוקליין בנוירונים דופמין. מדגימה את ההליך תהיה יוליה קונובלובה, דוקטורנטית מהמעבדה שלי.
לפני הגדרת תרבות תאי midbrain העוברי הראשי, להוסיף 50 microliters של דופמין, מדיום נוירון, לכל באר של פולי L-Ornithine מצופה 96 צלחת גם ולהשתמש 100 טיפ פיפט microliter כדי לצרף את המדיום בעת ובעונה אחת מגרד את החלק התחתון של כל באר בכיוון מעגלי כדי להסיר את הציפוי בהיקף של כל באר. אי מצופה פולי-ל-אורניתין יישאר באמצע כל באר. הוסף 10 microliters של בינוני עד אמצע כל אי מצופה כדי ליצור איים מיקרו.
כדי להקים תרבויות midbrain עוברי ראשי מיום עוברי העכבר 13.5 עוברי עכבר. בריכה כל רצפות midbrain שנקטפו לתוך אותו צינור 1.5 מיליליטר ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם 500 microliters של סידן ומגנזיום חינם HBSS לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה להחליף את HBSS עם 0.5% טריפסין עבור דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
בסוף הדגירה להוסיף 500 microliters של DNase I מוכן טרי בתת פתרון FBS לרקמות מתעכל חלקית ולהשתמש פיפטה זכוכית סיליקון עם קצה מלוטש אש כדי triturate את הרקמה. כאשר רק חלקיקים זעירים, בקושי גלוי ניתן לראות לאפשר שברי רקמה אלה להתיישב לתחתית צינור מיקרו צנטריפוגה ולהעביר את זה supernatant לתוך צינור פוליפרופילן חרוטי ריק 15 מיליליטר. מוסיפים מיליליטר אחד של HBSS לצינור המכיל DNase I ב- FBS ומערבבים מספר פעמים על ידי צינורות.
העבר מיליליטר אחד של פתרון זה לחלקיקי הרקמה הנותרים ו triturate הדגימות שוב. ואז למשוך את ההשעיה התא מתעכל עם הצינור של supernatant מבלי להעביר את כל שברי הרקמה הנותרים לאחר triturating מדגם הרקמה עוד פעם אחת עם DNase I ו- FBS הנותרים ב HBSS להכביד את התאים שנאספו על ידי צנטריפוגה ולזעור את supernatant מבלי להפריע גלולה. לשטוף את התאים פעמיים בשני מיליליטר של נוירון דופמין מחומם בינוני לכל לשטוף.
ולתלות מחדש את התאים בשלוש פעמים 10 לתאי הכוח לכל שישה מיקרוליטרים של ריכוז חם ובינוני טרי בצינור מיקרו צנטריפוגה. לאחר מכן להסיר את המדיום מכל אי מיקרו שהוכן בעבר לערבב את התאים עם צינורות עדינים לפני השימוש פיפטה 10 microliter להוסיף שישה microliters של תאים לכל אי מיקרו. כאשר כל התאים נוספו, למלא את הבארים הריקים בשולי הצלחת עם 150 microliters של מים או PBS ולמקום את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך שעה אחת.
בסוף האינקובציה להוסיף 100 microliters של נוירון דופמין טרי בינוני לכל באר ולהחזיר את הצלחת לאנקובטור. ביום השמיני של תרבות התאים במכסה המנוע של זרימה למינארית להוסיף ב 3.75 microliters של 100 מיקרוגרם למיליליטר של fibrils preformED לכל באר ניסיונית, ו 3.75 microliters של PBS לכל באר שליטה. בעת עבודה עם PFS להיות זהיר לגבי זיהום חלבון לא רצוי ולאחר מכן לנקות את מכסה המנוע ואת כל המכשירים הקשורים PF עם 1%SDS ו 70%אתנול.
בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה לאחר הכתמה עבור סמני העניין, טען את לוחית התרבות של 96 בארות על סורק לוח תוכן גבוה המצויד במטרה של 10 X. התאם את ההגדרות בהתאם למפרטים של צלחת 96 באר כגון סוג המשחק, היצרן, גודל, מרחק בין בארות, ואת סוג ונפח של בינוני. בחר את אזור ההדמיה של הבארים כדי לכסות את כל התאים בכל אי מיקרו ולהשתמש באר אחת כדי להתאים את המוקד האוטומטי על ביטוי DAPI.
כייל את זמן הרכישה עבור כל ערוץ פלואורסצנטי בהתבסס על עוצמת הכתמים בארות הבקרה והתאם את הפרמטרים כך שתאי הדופמין בבריון בעל מבנה מקדים טיפלו בארות שליטה מחסה זרחן 129 צבירות אלפא סינוקליין בתוך התא סומא בבירור להיות מכובד המאפשר כימות חד משמעי של פוספוספין 129 אלפא סינוקליין חיובי ושלילי תאים. ואז תמונה כל בארות שנבחרו בו זמנית בכל הערוצים באמצעות בדיוק את אותם פרמטרים עבור כל באר. לניתוח התמונות, פתח את מנתח CellProfiler ובחר את V2_THpos.
קובץ מאפיינים. כדי למיין תאים מקוטעים לתוך פוספוספין 129 אלפא סינוקליין תאים חיוביים ושליליים להגדיר תחילה את מספר תאים להביא 50 תאים אקראיים ולחץ להביא לטעון תמונות של התאים מקוטעים. גרור לפחות 30 תאים לתוך הפח המתאים בתחתית החלון.
בחר השתמש בהגברה עדינה ומהירה עם 50 כללים מרביים או מסווגי יער אקראיים ולחץ על רכבת. הגדר להביא 50 תאים חיוביים ולחץ להביא כדי לרכוש זרחן חיובי דוגמה 129 אלפא סינוקליין תאים הבקיע על פי מסווג הרכבת או להגדיר להביא 50 תאים שליליים ולחץ להביא לרכוש פוספוסרין שלילי לדוגמה 129 אלפא סינוקליין תאים על פי מסווג הרכבת. כאשר התוצאות משביעות רצון, לחץ על ציון כל כדי ליצור טבלת תוצאות המסכמת את מספר פוספוזרין 129 אלפא סינוקליין נוירונים חיוביים ושליליים דופמין בכל באר.
ימים ספורים לאחר ציפוי תרבות התפשטות הומוגנית ניתן לראות על ידי מיקרוסקופ אור בתוך האי מיקרו שנוצר לפני ציפוי. נוירונים ראשוניים להתיישב על צלחת מצופה התחתון הומוגנית ולהקים תחזיות עצביות. בתמונה זו, גוש קטן של תאים פחות מ 150 מטר קוטר ניתן לראות.
כתמים חיסוניים של שליטה עכבר ראשוני מטופל באמצע המוח תרבויות עם סמני תא עצבי 15 ימים לאחר הציפוי מגלה התקשרות מוגבלת של התאים בתוך האיים מיקרו באמצע בארות הלוח. דופמין נוירונים אימונו שכותרתו עם סמן טירוסין hydroxylase להתפשט ברחבי האי מיקרו מונולייר מופרדים זה מזה ללא כל גושים. ב תרבויות אלפא-סינוקליין מראש פיבריל מטופלים, pS129 אלפא סינוקליין תכלילים חיוביים ניתן גם לצפות.
טיפול עם פיברילים במבחנה מראש במשך שבעה ימים אינו גורם לירידה משמעותית במספרי נוירון חיובי טירוסין hydroxylase בהשוואה לקבוצות ניסיוניות אחרות. טיפול עם קו תא גליה נגזר גורם נוירוטרופי עם זאת, מקטין את אחוז pS129 אלפא-synuclein הכללה חיובית, מחסה טירוסין הידרוקסילאז חיובי דופמין נוירונים. לפני יצירת איי מיקרו, ודא כי בארות מצופות פולי-L ornithine נשטפים היטב.
כמו כן הקפד להשתמש במדיה טרייה בעת ציפוי תרבויות מוח חדשות. ניתן לשלב את השיטה עם עריכת גנים ומעכבים תרופתיים כדי לחקור את ההשפעות של גנים ספציפיים וגלי מחשבה על צבירת גרעין. אנו משתמשים בשיטה זו באופן שגרתי כדי לסנן עבור מולקולות חדשות המעכבות הצטברות אלפא סינוקליין.
הדגימו את ההשפעות המוגנות על הצטברות של TDN וכיום מנתחים מספר מולקולות מועמדים קטנות.
