Dieses Protokoll bietet ein robustes, reproduzierbares Modell der Alpha-Synuclein-Akkumulation in primären Dopamin-Neuronen für die Untersuchung der Mechanismen und Behandlungen, die diese Akkumulation regulieren können. Vorgeformte Alpha-Synuclein-Fibrillen induzieren eine fortschreitende, hochreproduzierbare Proteinakkumulation in Kombination mit automatisierter Bildgebung und unvoreingenommener Bildanalyse, dieses Protokoll ermöglicht ein relativ schnelles, mittleres bis hohes Durchsatzscreening von Alpha-Synuclein-Akkumulations-Hemmenden. Progressive Alpha-Synuclein Akkumulation kann einer der Faktoren sein, die neuronale Funktion bei der Parkinson-Krankheit und bestimmten Kernkörpern beeinträchtigen.
Neue Moleküle, die eine solche Akkumulation blockieren, können zu neuen Therapien für Neurodegeneration werden. Wir glauben, dass dieses Protokoll ein wichtiger Schritt für die Etablierung eines Standard-und zuverlässigen Werkzeugs zur Untersuchung molekularer Mechanismen zur Regulierung der Alpha-Synuclein-Akkumulation in Dopamin-Neuronen ist. Demonstriert wird das Verfahren von Julia Konovalova, einer Doktorandin aus meinem Labor.
Vor dem Einrichten der primären embryonalen Midbrain-Zellkultur, fügen Sie 50 Mikroliter Dopamin, das Neuronenmedium, zu jedem Brunnen der Poly-L-Ornithin beschichteten 96-Well-Platte hinzu und verwenden Sie eine 100-Mikroliter-Pipettenspitze, um das Medium zu aspirieren, während gleichzeitig der Boden jedes Brunnens in kreisförmiger Richtung zerkratzt wird, um die Beschichtung am Umfang jedes Brunnens zu entfernen. Eine poly-L-Ornithine-beschichtete Insel wird in der Mitte jedes Brunnens bleiben. Fügen Sie 10 Mikroliter Medium bis mitte jeder beschichteten Insel hinzu, um Mikroinseln zu schaffen.
So richten Sie primäre embryonale Midbrain-Kulturen aus dem Maus-Embryonaltag 13,5-Maus-Embryonen ein. Alle geernteten Mittelhirnböden in das gleiche 1,5-Milliliter-Rohr einsammeln und die Proben dreimal mit 500 Mikroliter Calcium- und Magnesiumfrei-HBSS pro Waschgang waschen. Nach der letzten Wäsche ersetzen Sie die HBSS mit 0,5%Trypsin für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius.
Am Ende der Inkubation 500 Mikroliter einer frisch zubereiteten DNase I in FBS-Lösung in das teilweise verdaute Gewebe geben und eine silikonisierte Glaspipette mit einer feuerpolierten Spitze verwenden, um das Gewebe zu trituieren. Wenn nur winzige, kaum sichtbare Partikel beobachtet werden können, können sich diese Gewebefragmente auf den Boden des Mikrozentrifugenrohrs absetzen und diesen Überstand in ein leeres 15 Milliliter konisches Polypropylenrohr übertragen. Fügen Sie dem Rohr, das DNase I in FBS enthält, einen Milliliter HBSS hinzuzufügen und durch Pipetieren mehrmals zu mischen.
Übertragen Sie einen Milliliter dieser Lösung auf die verbleibenden Gewebepartikel und trituieren Sie die Proben erneut. Ziehen Sie dann die verdaute Zellsuspension mit dem Röhre des Überstandes, ohne verbleibende Gewebefragmente zu übertragen, nachdem sie die Gewebeprobe ein beliebiges Mal mit den restlichen DNase I und FBS in HBSS-Sediment die gesammelten Zellen durch Zentrifugation trituiert haben, und den Überstand ansaugen, ohne das Pellet zu stören. Waschen Sie die Zellen zwei Mal in zwei Milliliter n.A. erwärmtem Dopamin-Neuron-Medium pro Wäsche.
Und setzen Die Zellen dreimal 10 zu den Kraftzellen pro sechs Mikroliter frischwarmer, mittlerer Konzentration in einem Mikrozentrifugenrohr aus. Als nächstes entfernen Sie das Medium von jeder zuvor vorbereiteten Mikroinsel und mischen Sie die Zellen mit sanfter Pipettierung, bevor Sie eine 10-Mikroliter-Pipette verwenden, um jeder Mikroinsel sechs Mikroliter Zellen hinzuzufügen. Wenn alle Zellen hinzugefügt wurden, füllen Sie die leeren Brunnen an den Rändern der Platte mit 150 Mikroliter Wasser oder PBS und legen Sie die Platte für eine Stunde in den Zellkultur-Inkubator.
Am Ende der Inkubation fügen Sie 100 Mikroliter frisches Dopamin-Neuron-Medium zu jedem Brunnen hinzu und geben Sie die Platte an den Inkubator zurück. An Tag acht der Zellkultur in einer laminaren Strömungshaube addieren Sie mit 3,75 Mikrolitern von 100 Mikrogramm pro Milliliter vorgeformte Fibrillen zu jedem Experimentierbrunnen und 3,75 Mikroliter PBS zu jedem Kontrollbrunnen. Bei der Arbeit mit PFS vorsichtig sein, was unerwünschte Proteinkontamination und anschließend reinigen Sie die Haube und alle PF zugehörigen Instrumente mit 1%SDS und 70%Ethanol.
Laden Sie die 96-Brunnenkulturplatte nach der Färbung für die Marker von Interesse an den entsprechenden experimentellen Endpunkt auf einen mit einem 10-X-Objektiv ausgestatteten Plattenscanner mit hohem Inhalt. Passen Sie die Einstellungen entsprechend den Spezifikationen der 96-Well-Platte wie Spielart, Hersteller, Größe, Abstand zwischen den Brunnen und Art und Volumen des Mediums an. Wählen Sie den Bildbereich der Brunnen aus, um alle Zellen auf jeder Mikroinsel abzudecken, und verwenden Sie einen Brunnen, um den Autofokus auf den DAPI-Ausdruck anzupassen.
Kalibrieren Sie die Erfassungszeit für jeden Fluoreszenzkanal basierend auf der Intensität der Färbung in den Kontrollbrunnen und passen Sie die Parameter so an, dass die Dopaminzellen in den vorgeformten fibril behandelten Kontrollbrunnen, die Phosphoserin 129 Alpha-Synuclein-Aggregate innerhalb des Zellsomas beherbergen, klar unterschieden werden, was eine eindeutige Quantifizierung des Phosphoserins 129 alpha synuclein positive und negative Zellen ermöglicht. Dann bilden Sie alle ausgewählten Brunnen gleichzeitig in allen Kanälen mit genau den gleichen Parametern für jeden Brunnen. Öffnen Sie cellProfiler Analyst, und wählen Sie für die Analyse der Bilder den V2_THpos aus.
Eigenschaftendatei. Um segmentierte Zellen in Phosphoserin 129 Alphasynuclein-positive und negative Zellen zu sortieren, legen Sie zuerst die Anzahl der Abrufzellen auf 50 zufällige Zellen fest und klicken Sie auf Abrufen, um Bilder der segmentierten Zellen zu laden. Ziehen Sie mindestens 30 Zellen in den entsprechenden Lagerplatz am unteren Rand des Fensters.
Wählen Sie schnell sanftes Steigern mit 50 max Regeln oder zufälligen Waldklassifikatoren und klicken Sie auf Zug. Legen Sie fetch auf 50 positive Zellen und klicken Sie auf fetch, um Beispiel positive Phosphoserin 129 Alpha-Synuclein-Zellen nach dem Zugklassifier bewertet zu erwerben oder auf 50 negative Zellen zu holen und auf holen zu klicken, um Beispiel negative Phosphoserin 129 Alpha-Synuclein-Zellen entsprechend dem Zugklassifier zu erhalten. Wenn die Ergebnisse zufriedenstellend sind, klicken Sie auf Punkte, um eine Ergebnistabelle zu generieren, die die Anzahl der Phosphoserin 129 Alpha-Synuclein-positive und negative Dopamin-Neuronen in jedem Brunnen zusammenfasst.
Wenige Tage nach der Beschichtung kann eine homogen eitel verbreitete Kultur durch Lichtmikroskopie innerhalb der Mikroinsel beobachtet werden, die vor der Beschichtung erstellt wurde. Primäre Neuronen setzen sich auf dem beschichteten Plattenboden homogen ab und stellen neuronale Projektionen auf. In diesem Bild kann ein kleiner Zellklumpen mit einem Durchmesser von weniger als 150 Mikrometern beobachtet werden.
Die Immunfärbung der Kontrolle unbehandelte primäre Maus-Mittelhirnkulturen mit neuronalen Zellmarkern 15 Tage nach der Beschichtung zeigt eine eingeschränkte Anhaftung der Zellen innerhalb der Mikroinseln in der Mitte der Plattenbrunnen. Dopamin-Neuronen Immun mit Tyrosin-Hydroxylase-Marker gekennzeichnet verbreiten sich um die Mikroinsel in einer Monoschicht voneinander getrennt ohne Klumpen. In Alpha-Synuclein vorgeformten fibril behandelten Kulturen können auch pS129 Alpha-Synuclein-positive Einschlüsse beobachtet werden.
Die Behandlung mit in vitro vorgeformten Fibrillen für sieben Tage führt nicht zu einer signifikanten Abnahme der Tyrosinhydroxylase-positiven Neuronenzahlen im Vergleich zu anderen experimentellen Gruppen. Behandlung mit Gliazelllinie abgeleitet neurotrophen Faktor jedoch, reduziert den Prozentsatz der pS129 alpha-Synuclein positive Einbeziehung, beherbergen Tyrosin Hydroxylase positive Dopamin-Neuronen. Bevor Sie Mikroinseln erstellen, stellen Sie sicher, dass die poly-L Ornithin beschichteten Brunnen fest gewaschen werden.
Achten Sie auch darauf, frische Medien zu verwenden, wenn Sie neue Gehirnkulturen plattieren. Die Methode kann mit Genbearbeitung und pharmakologischen Inhibitoren kombiniert werden, um die Auswirkungen bestimmter Gene und Gedankenwellen auf die Nukleonaggregation zu untersuchen. Wir verwenden diese Methode routinemäßig, um nach neuen Molekülen zu suchen, die die Alpha-Synuclein-Akkumulation hemmen.
Haben die Akkumulationsgeschützte Wirkung von TDN demonstriert und derzeit mehrere kleine Kandidatenmoleküle analysiert.
