Agradecemos al Centro de Genética Caenorhabditis, financiado por el Centro Nacional de Recursos de Investigación (NCRR) de los NIH, por algunas de las cepas de nematodos. Los anticuerpos monoclonales desarrollados por H.F. Epstein se obtuvieron del Developmental Studies Hybridoma Bank desarrollado bajo los auspicios del NICHD y mantenido por el Departamento de Biología de la Universidad de Iowa. Esta investigación fue apoyada por una subvención de la Fundación de Ciencias de Israel (subvención No. 278/18) y por una subvención del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Israel, y el Ministerio de Relaciones Exteriores y Cooperación Internacional, Dirección General de Promoción del País, República Italiana (subvención No. 3-14337). Agradecemos a los miembros del laboratorio Ben-Zvi por su ayuda en la preparación de este manuscrito.

1. Preparación de placas de medios de crecimiento de nematodos para RNAi
<ol><li>A una botella de 1 L, agregue 3 g de NaCl, 2,5 g de Bacto-Peptona, 17 g de agar y agua destilada hasta 1 L y autoclave.</li>
	<li>Enfríe la botella a 55 °C.</li>
	<li>Añadir 25 mL de 1 M KH2PO4, pH 6.0, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, y 1 mL de solución de colesterol (Tabla 1) para hacer nematodos medios de crecimiento (NGM).</li>
	<li>Añadir 1 ml de ampicilina (100 mg/ml) y 0,5 ml de 1 M de IPTG (Tabla 1) para hacer la solución de NGM-ARNi. NOTA: La bacteria E. coli HT115 (DE3) de uso común contiene una ADN polimerasa T7 inducible por IPTG utilizada para expresar los plásmidos que codifican dsRNA. Estos plásmidos también codifican para la resistencia a la ampicilina.</li>
	<li>Mezcle la solución tibia removiendo la botella.</li>
	<li>En la campana o utilizando procedimientos estériles, vierta la solución de NGM en placas o usando una bomba peristáltica, dispense la solución en placas. Utilice placas de 6 pozos, 12 pozos, 40 mm o 60 mm para esta pantalla. El agar debe llenar aproximadamente 2/3 de la profundidad de la placa.</li>
	<li>Deje que las placas se sequen durante la noche en el banco a temperatura ambiente, manteniendo las placas cubiertas. Las placas NGM para RNAi se pueden almacenar a 4 °C durante un mes.</li>
</ol>2. Cultivo de bacterias RNAi y siembra de las placas
<ol><li>En la campana o mediante procedimientos estériles, añadir 1 ml de ampicilina (100 mg/ml) y 2,5 ml de tetraciclina (5 mg/ml) (Tabla 1) a una solución de LB de 1 L preautoclave y mezclar. NOTA: Las bacterias HT115 (DE3) E. coli de uso común son resistentes a la tetraciclina.</li>
	<li>En la campana o utilizando procedimientos estériles, agregue 600 μL de solución de LB a cada pozo en placas estériles de 96 ormentos de 2 ml de profundidad. Lo mejor es utilizar una pipeta multicanal para dispensar los medios.</li>
	<li>Mediante procedimientos estériles, inocular pozos con bacterias HT115(DE3) E. coli transformadas con un plásmido codificante de dsRNA dirigido a un gen de interés o a un plásmido vacío, como control. Cubra las placas e incube a 37 °C durante la noche. Las bibliotecas que consisten en clones bacterianos que expresan dsRNA, correspondientes a ~ 94% de los genes predichos de C. elegans se construyeron previamente22,23 y están disponibles comercialmente. La biblioteca de acompañantes utilizada aquí fue construida por el laboratorio del Dr. Richard Morimoto26.</li>
	<li>Utilizando procedimientos estériles, seeste 75, 150 o 250 μL de bacterias en las placas de ARNi NGM de 12 pozos, 40 mm y 6 o 60 mm, respectivamente. Marque claramente el nombre del gen objetivo en la placa. Las bacterias deben cubrir el 30-50% de la superficie del agar y no deben tocar los bordes de la placa.</li>
	<li>Deje que las placas se sequen durante al menos 2 días en el banco a temperatura ambiente, manteniendo las placas cubiertas. NOTA: Las placas se pueden incubar a 37 °C durante la noche. Asegúrese de que los pozos interiores estén secos antes de usar o almacenar las placas. Para todos los fines a largo plazo (es decir, secado o almacenamiento) mantenga las placas en la oscuridad. Las placas secas y secuedradas se pueden almacenar a 4 °C hasta por un mes.</li>
</ol>3. Sincronización no estresante de embriones
<ol><li>Use una púa de gusano para mover alrededor de 100 huevos de una placa de gusano no sincronizada a una placa NGM recién secuenada.</li>
	<li>Cultive animales durante 5 días a 15 °C, 3,5 días a 20 °C o 2,5 días a 25 °C. Los animales deben llegar al primer día de puesta de huevos. NOTA: Los gusanos se cultivan comúnmente a 20 ° C. Sin embargo, diferentes cepas mutantes chaperonas pueden requerir temperaturas de cultivo específicas. Por ejemplo, muchas cepas sensibles a la temperatura se cultivan a 15 °C, pero se desplazan a 25 °C para exponer su fenotipo.</li>
	<li>Agregue 1 ml de tampón M9(Tabla 1)lentamente y lejos del césped bacteriano. Gire la placa para que el tampón cubra completamente la placa. Luego inclínelo hacia un lado y retire el líquido del plato y lave a los animales del plato. NOTA: Cuando se utilizan animales sensibles a la temperatura o mutantes chaperones, es mejor mantener los tampones utilizados en el protocolo a la temperatura de cultivo de los animales.</li>
	<li>Repita el paso 3.3 tres veces o hasta que todos los animales se laven del plato.</li>
	<li>Usando una punta de plástico estándar, corte un cuadrado de agar del plato lavado donde se concentran los huevos y coloque el trozo de agar en un plato NGM recién sembrado. NOTA: Se requieren ~ 200 huevos para producir suficientes animales que ponen huevos; demasiados animales consumen la bacteria demasiado rápido. Los niveles bajos de alimentos pueden afectar la proteostasis27.</li>
	<li>Cultive los animales durante 5 días a 15 °C, 3,5 días a 20 °C o 2,5 días a 25 °C. En este punto, las placas deben cubrirse con huevos sincronizados. NOTA: Los animales se pueden cambiar a una nueva placa durante un corto período de tiempo para una sincronización más estricta. Sin embargo, es importante usar solo adultos en las primeras etapas de la puesta de huevos, ya que los animales pueden retener los huevos en su útero afectando la sincronización.</li>
	<li>Agregue 1 ml de tampón M9 lentamente y lejos del césped bacteriano.</li>
	<li>Gire la placa para que el tampón cubra completamente la placa. Luego inclínelo hacia un lado y retire el líquido del plato y lave a los animales del plato.</li>
	<li>Repita el paso 3.7 tres veces o hasta que todos los animales se laven del plato.</li>
	<li>Agregue 1 ml de tampón M9 y use un raspador de células para liberar los huevos de la placa.</li>
	<li>Recoge el tampón M9 que contiene los huevos de las placas.</li>
	<li>Centrifugar el tampón M9 que contiene los huevos a 3.000 x g durante 2 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y agregue el búfer M9 para alcanzar un volumen de 1 ml.</li>
	<li>Resuspenda los huevos para interrumpir cualquier trozo de huevos y bacterias.</li>
	<li>Repita el procedimiento de lavado descrito en los pasos 3.11-3.13 cinco veces. El pellet de huevo debe aparecer blanco. Si todavía es amarillo / marrón, repita el lavado hasta que se alcance un gránulo blanco. NOTA: Las bacterias que permanecen en los huevos pueden contaminar las bacterias que expresan dsRNA.</li>
	<li>Retire la mayor parte del sobrenadante, dejando unos 200 μL. Los huevos sincronizados se pueden usar para pantallas de ARNi.</li>
</ol>4. Ensayos fenotípicos comunes
<ol><li>Cultivo de animales durante experimentos<ol>
<li>Coloque una gota de ~ 30 huevos cerca del césped bacteriano en cada placa con semillas de ARNi. Como referencia, también coloque ~ 30 huevos en placas secuesdas con bacterias vacías que contienen vectores (L4440).</li>
		<li>Cultive animales sincronizados por la edad en placas con semillas de ARNi NGM. La duración del experimento dependerá de la etapa en la que se controlará a los animales y de la temperatura de cultivo. Ajuste la temperatura de cultivo cuando use animales mutantes sensibles a la temperatura. Ajuste la duración del cultivo cuando use animales mutantes con retraso en el desarrollo. NOTA: Si bien el tiempo puede variar, una vez que los animales alcanzan la edad adulta, la puesta de huevos (y el consumo rápido de alimentos resultante), así como el colapso de proteostsis dependiente de la edad28, podrían afectar los resultados. Por lo tanto, se recomienda puntuar a los animales antes del inicio de la puesta de huevos (día 1 de la edad adulta). Los animales de tipo salvaje alcanzan esta etapa después de 4,5 días a 15 °C, 3 días a 20 °C o 2 días a 25 °C.</li>
		<li>El número de repeticiones utilizadas dependerá del tamaño del conjunto de genes examinado. Para la biblioteca de chaperonas (97 genes), repita los experimentos al menos cuatro veces. El tamaño de la población depende del ensayo utilizado. En los ensayos de comportamiento discutidos aquí, puntúa >15 animales por condición experimental en cada repetición. Los datos y los análisis estadísticos también dependen en gran medida del tipo de ensayo utilizado. Los datos en los ensayos discutidos aquí se pueden presentar como medios ± SEM.</li>
		<li>Compare los animales tratados con ARNi y control de vectores vacíos como poblaciones independientes. Los valores de P se pueden calcular utilizando ANOVA unidireccional o bidireccional, dependiendo de los cambios examinados, es decir, agravando o aliviando solo o ambos. Al examinar un solo tratamiento de ARNi frente a control, los valores de P se pueden calcular utilizando la prueba de suma de rango de Mann-Whitney unidirección o bidireccional. Aparte de la significación estadística, considere un umbral para los aciertos basado en el grado de impacto en el fenotipo.</li>
	</ol></li>
	<li>Detención/retraso en el desarrollo<ol>
<li>Cultive animales sincronizados por edad como en el paso 4.1 hasta que los animales cultivados en bacterias de control que contienen vectores vacíos alcancen la edad adulta, pero antes de que comience la puesta de huevos.</li>
		<li>Monitoree a los animales usando un estereomicroscópica y cuente el número de larvas y adultos para calificar el porcentaje de animales con retraso en el desarrollo. Como referencia, compare con animales mutantes cultivados en bacterias de control que contienen vectores vacíos. El tratamiento con ARNi hsp-1 o hsp-90 da como resultado la detención del desarrollo de animales de tipo salvaje y se puede utilizar como un control positivo.</li>
		<li>Para calificar el porcentaje de animales con retraso en el desarrollo a lo largo del tiempo, repita el paso 4.2.2. NOTA: Si hay adultos que ponen huevos en el plato, transfiera los animales retrasados por el desarrollo a una nueva placa NGM-RNAi etiquetada para el mismo gen objetivo para evitar confusiones con la progenie.</li>
	</ol></li>
	<li>Defectos de esterilidad o puesta de huevos<ol>
<li>Cultive animales sincronizados por edad como en el paso 4.1 hasta que los animales cultivados en bacterias vacías de control de vectores comiencen a poner huevos.</li>
		<li>Monitoree a los animales usando un estereomiroscopio y puntúe el porcentaje de animales sin óvulos visibles en su útero. Como referencia, compare con animales mutantes cultivados en bacterias vacías de control de vectores.</li>
		<li>Alternativamente, monitoree a los animales usando un estereomiroscopio y puntúe el porcentaje de animales con un útero lleno de huevos, definido como EGg Poneción defectuosa (Egl-d) fenotipo29.</li>
	</ol></li>
	<li>Letalidad embrionaria<ol>
<li>Cultive animales sincronizados por edad como en el paso 4.1 hasta que los animales comiencen a poner huevos.</li>
		<li>Transfiera ~ 100 huevos a un plato vacío. Extiende los huevos en filas para simplificar el conteo.</li>
		<li>Anote el porcentaje de huevos no eclostos en el plato después de 24-48 horas. Como referencia, compare con los huevos de animales tratados con bacterias de control de vectores vacías.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayo de parálisis<ol>
<li>Para los adultos del día 1, cultive animales sincronizados por la edad como en el paso 4.1 hasta que los animales cultivados en bacterias vacías de control de vectores alcancen la edad adulta, pero antes de que comience la puesta de huevos.</li>
		<li>Dibuja una línea en la parte posterior de una placa de agar NGM normal usando un marcador fino.</li>
		<li>Coloque de 5 a 10 animales en la línea marcada.</li>
		<li>Configure un temporizador y espere 10 minutos.</li>
		<li>Puntúe el porcentaje de animales que permanecen en la línea como gusanos paralizados. Como referencia, compare con animales mutantes cultivados en bacterias vacías de control de vectores. Los animales de tipo salvaje tratados con ARNi unc-45 muestran un fenotipo de parálisis severa y pueden usarse como control positivo. NOTA: Este ensayo destaca a los animales que muestran parálisis media a severa. Tales animales generalmente se encuentran rectos en el plato, en lugar de presentar la forma curva común. Además, un parche limpio de bacterias es visible alrededor de las cabezas de los gusanos paralizados.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayo de golpiza<ol>
<li>Cultive animales sincronizados por la edad como en el paso 4.1 hasta que los animales cultivados con bacterias vacías de control de vectores alcancen la edad adulta, pero antes de que comience la puesta de huevos.</li>
		<li>Pipete 100 μL de tampón M9 a la temperatura de cultivo de los animales en una placa de 96 pozos.</li>
		<li>Coloque ~ 15 gusanos, uno por pozo, en los pozos que contienen tampón M9.</li>
		<li>Deje que los animales se ajusten durante 5 min.</li>
		<li>Examine a cada animal bajo el estereomitroscopio, inicie un temporizador contando 15 s y cuente el número de curvas corporales que cada animal realiza en ese período de tiempo. Los valores contados se pueden normalizar a curvas corporales por minuto. Como referencia, compare con animales mutantes cultivados en bacterias vacías de control de vectores. NOTA: Este ensayo de motilidad es muy sensible y puede detectar diferencias muy leves entre los tratamientos. Sin embargo, la motilidad en líquido y la motilidad en agar pueden diferir.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Validación del derribo de proteínas
<ol><li>Coloque 250-300 huevos sincronizados en una placa NGM-RNAi de 60 mm secuesta con las bacterias relevantes que expresan dsRNA o que contienen vectores vacíos (L4440). NOTA: El derribo de ARNi podría resultar en una acumulación aberrante de embriones, en una falta de embriones o en una detención del desarrollo que podría afectar la expresión génica. Esto debe tenerse en cuenta al determinar la edad de los animales que se examinarán.</li>
	<li>Para adultos del día 1, cultive animales durante 4,5 días a 15 °C, 3 días a 20 °C o 2 días a 25 °C.</li>
	<li>Recoger y transferir un total de 200 animales adultos jóvenes a la tapa de un relleno de tubo de 1,5 ml con 200 μL de PBS-T. NOTA: Cuando se utilizan animales sensibles a la temperatura o mutantes chaperones, es mejor mantener los tampones utilizados en el protocolo a la temperatura de cultivo de los animales.</li>
	<li>Cierre la tapa con cuidado y centrífuga a 1.000 x g durante 1 min.</li>
	<li>Añadir 800 μL de PBS-T(Tabla 1)y centrifugar a 1.000 x g durante 1 min.</li>
	<li>Retire con cuidado los 900 μL superiores.</li>
	<li>Repita los pasos 5.4-5.6 tres veces.</li>
	<li>Retire 900 μL, dejando 100 μL de solución que contiene los 200 gusanos.</li>
	<li>Añadir 25 μL de búfer de muestra 5x (Tabla 1).</li>
	<li>Calentar las muestras durante 10 min a 92°C mientras agita a 1000 rpm. Las muestras pueden congelarse y conservarse a -20 °C.</li>
	<li>Cargue 20 μL de cada muestra y ejecute en un gel SDS-PAGE.</li>
	<li>Realizar análisis de western blot utilizando anticuerpos apropiados para determinar la estabilidad relativa de la proteína.</li>
	<li>Determine la intensidad de las bandas utilizando software densitométrico, como el módulo de gel ImageJ disponible gratuitamente. Normalice todos los valores a los medidos en la(s) muestra(s) de control. NOTA: El objetivo de la eliminación de ARNi en nuestras pantallas es reducir los niveles de proteína de una chaperona / co-chaperona específica. Por lo tanto, la mejor manera de evaluar la eficiencia del derribo de ARNi es mediante el análisis de western blot. Esto requiere anticuerpos específicos. Alternativamente, la qPCR se puede utilizar para cuantificar los niveles de ARNm.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Sigue faltando una imagen integrada de la red de proteostasis que refleje cómo está organizada y funciona en diferentes células y tejidos metazoarios. Para abordar esta deficiencia, se requiere información específica sobre las interacciones de varios componentes de esta red, como las chaperonas moleculares, en tejidos específicos durante el curso del desarrollo y el envejecimiento. Aquí, mostramos cómo el uso de perturbaciones específicas del tejido nos permitió examinar la red de chaperonas en un tejido dado. ...

Las células hacen frente al daño de las proteínas mediante el empleo de maquinarias de control de calidad que reparan, secuestran o eliminan cualquier proteína dañada1,2. El plegamiento y el ensamblaje de complejos de proteínas están respaldados por chaperonas moleculares, un grupo diverso de proteínas altamente conservadas que pueden reparar o secuestrar proteínas dañadas3,4,5,6,7. La eliminación de proteínas dañadas está mediada por el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS)8 o por la maquinaria de autofagia9 en colaboración con chaperonas10,11,12. La homeostasis proteica (proteostasis) se mantiene, por lo tanto, mediante redes de control de calidad compuestas por maquinarias de plegamiento y degradación3,13. Sin embargo, comprender las interacciones entre los diversos componentes de la red de proteostasis in vivo es un desafío importante. Si bien las pantallas de interacción proteína-proteína aportan información importante sobre las interacciones físicas y los complejos de chaperonas14,15, es deficiente comprender la organización y los mecanismos compensatorios dentro de las redes de chaperonas específicas de los tejidos in vivo.
Las interacciones genéticas se utilizan a menudo como una herramienta poderosa para examinar la relación entre pares de genes que están involucrados en vías biológicas comunes o compensatorias16,17,18. Tales relaciones se pueden medir combinando pares de mutaciones y cuantificando el impacto de una mutación en un gen en la gravedad fenotípica causada por una mutación en el segundo gen16. Si bien la mayoría de estas combinaciones no muestran ningún efecto en términos de fenotipo, algunas interacciones genéticas pueden agravar o aliviar la gravedad del fenotipo medido. Las mutaciones agravantes se observan cuando el fenotipo del mutante de doble deleción es más grave que el fenotipo esperado visto al combinar los mutantes de deleción simple, lo que implica que los dos genes funcionan en vías paralelas, afectando juntos a una función dada. Por el contrario, se observan mutaciones de alivio cuando el fenotipo del mutante de doble deleción es menos grave que el fenotipo observado con los mutantes de deleción simple, lo que implica que los dos genes actúan juntos como un complejo o participan en la misma vía16,18. En consecuencia, se han utilizado diversos fenotipos que se pueden cuantificar, incluidos fenotipos amplios, como la letalidad, las tasas de crecimiento y el tamaño de la cría, así como fenotipos específicos, como los reporteros transcripcionales, para identificar interacciones genéticas. Por ejemplo, Jonikas et al. se basaron en un reportero de estrés de ER para examinar las interacciones de la red de proteostasis de respuesta proteica desplegada por Saccharomyces cerevisiae ER utilizando análisis de deleción de genes por pares19.
Las pantallas de interacción genética implican el cruce sistemático de mutaciones de deleción por pares para generar un conjunto completo de mutantes dobles20. Sin embargo, en modelos animales, y específicamente en C. elegans,este enfoque a gran escala no es factible. En cambio, las cepas mutantes pueden ser probadas por sus patrones de interacción genética mediante la regulación a la baja de la expresión génica utilizando la interferencia de ARN (RNAi)21. C. elegans es un potente sistema para pantallas basado en RNAi22,23. En C. elegans, laentrega de ARN de doble cadena (dsRNA) se logra mediante la alimentación bacteriana, lo que lleva a la propagación de moléculas de dsRNA a numerosos tejidos. De esta manera, las moléculas de dsRNA introducidas impactan al animal a través de un procedimiento rápido y sencillo21. Una pantalla de interacción genética utilizando RNAi puede, por lo tanto, revelar el impacto de la regulación a la baja de un conjunto de genes o la mayoría de los genes codificantes de C. elegans utilizando bibliotecas de RNAi24. En dicha pantalla, los golpes que impactan en el comportamiento del mutante de interés pero no en la cepa de tipo salvaje son potenciales modificadores del fenotipo que se está monitoreando25. Aquí, aplicamos una combinación de mutaciones y cribado de ARNi para mapear sistemáticamente las interacciones de chaperonas específicas de tejidos en C. elegans.

<table><tbody><tr><td>12-well-plates</td><td>SPL</td><td>BA3D16B</td><td></td></tr><tr><td>40 mm plates</td><td>Greiner Bio-one</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>60 mm plates</td><td>Greiner Bio-one</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>96 well 2 mL 128.0/85mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>780278</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Formedium</td><td>AGA03</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Formedium</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>Sigma</td><td>BO126-25G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Qimaging</td><td>q30548</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Amresco</td><td>0433-250G</td><td></td></tr><tr><td>Confocal</td><td>Leica</td><td>DM5500</td><td></td></tr><tr><td>Filter (0.22 &amp;micro;m)</td><td>Sigma</td><td>SCGPUO2RE</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ165FC</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Frutarom</td><td>2355519000024</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Formedium</td><td>367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Bio-Lab</td><td>001649029100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>22189-08-8</td><td>Gift from the Morimoto laboratory</td></tr><tr><td>Myosin MHC A (MYO-3) antibody</td><td>Hybridoma Bank</td><td>5-6</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>s-0751</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-Lab</td><td>001903029100</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Merck</td><td>61930705001730</td><td></td></tr><tr><td>Plate pouring pump</td><td>Integra</td><td>does it p920</td><td></td></tr><tr><td>RNAi Chaperone library</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>VWR Life Science</td><td>0837-500</td><td></td></tr><tr><td>&amp;szlig;-mercaptoethanol</td><td>Bio world</td><td>41300000-1</td><td></td></tr><tr><td>stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>64-75-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Bio-Lab</td><td>002009239100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions

El correcto plegamiento y ensamblaje de proteínas y complejos proteicos es esencial para la función celular. Las células emplean vías de control de calidad que corrigen, secuestran o eliminan las proteínas dañadas para mantener un proteoma saludable, asegurando así la proteostasis celular y previniendo un mayor daño proteico. Debido a las funciones redundantes dentro de la red de proteostasis, la detección de fenotipos detectables mediante el derribo o mutaciones en genes que codifican chaperonas en el organismo multicelular Caenorhabditis elegans da como resultado la detección de fenotipos menores o nulos en la mayoría de los casos. Hemos desarrollado una estrategia de detección dirigida para identificar las chaperonas necesarias para una función específica y, por lo tanto, cerrar la brecha entre el fenotipo y la función. Específicamente, monitoreamos las nuevas interacciones de chaperonas utilizando pantallas de interacción sintética de ARNi, derribando la expresión de chaperonas, una chaperona a la vez, en animales portadores de una mutación en un gen que codifica chaperona o sobreexpresando una chaperona de interés. Al interrumpir dos chaperonas que individualmente no presentan fenotipo grueso, podemos identificar chaperonas que agravan o exponen un fenotipo específico cuando ambas perturban. Demostramos que este enfoque puede identificar conjuntos específicos de chaperonas que funcionan juntas para modular el plegamiento de una proteína o complejos de proteínas asociados con un fenotipo dado.

Uso de mutaciones sensibles a la temperatura en UNC-45 para detectar interacciones agravantes o de alivio en condiciones permisivas o restrictivas, respectivamente El ensamblaje y mantenimiento muscular ofrece un sistema eficaz para estudiar las interacciones de chaperonas específicas del tejido. La unidad funcional de los músculos contráctiles, el sarcómero, presenta una disposición cristalina de proteínas estructurales y reguladoras. La estabilidad de la proteína motora miosina y su incorpora...

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Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Para estudiar las interacciones chaperona-chaperona y chaperona-sustrato, realizamos pantallas de interacción sintética en Caenorhabditis elegans utilizando interferencia de ARN en combinación con mutaciones leves o sobreexpresión de chaperonas y monitoreamos la disfunción proteica específica del tejido a nivel del organismo.

Uso de Caenorhabditis elegans para detectar interacciones de chaperonas específicas del tejido

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

2.8K vistas.  Ben-Gurion University of the Negev. Para estudiar las interacciones chaperona-chaperona y chaperona-sustrato, realizamos pantallas de interacción sintética en Caenorhabditis elegans utilizando interferencia de ARN en combinación con mutaciones leves o sobreexpresión de chaperonas y monitoreamos la disfunción proteica específica del tejido a nivel del organismo.

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Un método Simple para la detección química de alto rendimiento en Caenorhabditis Elegans

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Investigación

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Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in several diseases including cancer. The free-living nematode C. elegans possesses an evolutionary and functionally conserved EGFR-RAS-ERK MAP signal cascade which is central for the development of the vulva. Gain of function mutations in RAS homolog LET-60 and EGFR homolog LET-23 induce the generation of visible nonfunctional ectopic pseudovulva along the ventral body wall of these worms. Previously, the multivulval (Muv) phenotype in these worms has been shown to be inhibited by small chemical molecules. Here we describe a protocol for using the worm in a liquid-based assay to identify inhibitors that abolish the activities of EGFR and RAS proteins. Using this assay, we show R-fendiline, an indirect inhibitor of K-RAS, suppresses the Muv phenotype expressed in the let-60(n1046) and let-23(sa62) mutant worms. The assay is simple, inexpensive, is not time consuming to setup, and can be used as an initial platform for the discovery of anticancer therapeutics.

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The genetically tractable nematode Caenorhabditis elegans can be used as a simple and inexpensive model for drug discovery. Described here is a protocol to identify anticancer therapeutics that inhibit the downstream signaling of RAS and EGFR proteins.

Identificación de inhibidores de EGFR y RAS mediante Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

Investigación sobre el cáncer

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or identification of new ones can provide invaluable information about the function of a protein of interest. Some of the traditional methods for extract preparation frequently require labor-intensive and time-consuming techniques. Here, a modified extract preparation protocol using a bead mill homogenizer and metal beads is described as a rapid alternative to traditional protein preparation methods. This extract preparation method is compatible with downstream co-immunoprecipitation studies. As an example, the method was used to successfully co-immunoprecipitate&#160;C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 and two known ALG-1 interactors: AIN-1, and HRPK-1. This protocol includes descriptions of animal sample collection, extract preparation, extract clarification, and protein immunoprecipitation. The described protocol can be adapted to test for interactions between any two or more endogenous, endogenously tagged, or overexpressed C. elegans proteins in a variety of genetic backgrounds.

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

This method describes a protocol for high-throughput protein extract preparation from Caenorhabditis elegans samples and subsequent co-immunoprecipitation.

Preparación de extractos de proteínas y co-inmunoprecipitación de Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

Biología del Desarrollo

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Selección de alto rendimiento y biosensores fluorescentes con C. elegans Las cepas

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biología

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity

Age-related misfolding and aggregation of pathogenic proteins are responsible for several neurodegenerative diseases. For example, Huntington&#39;s disease (HD) is principally driven by a CAG nucleotide repeat that encodes an expanded glutamine tract in huntingtin protein. Thus, the inhibition of polyglutamine (polyQ) aggregation and, in particular, aggregation-associated neurotoxicity is a useful strategy for the prevention of HD and other polyQ-associated conditions. This paper introduces generalized experimental protocols to assess the neuroprotective capacity of test compounds against HD using established polyQ transgenic Caenorhabditis elegans models. The AM141 strain is chosen for the polyQ aggregation assay as an age-associated phenotype of discrete fluorescent aggregates can be easily observed in its body wall at the adult stage due to muscle-specific expression of polyQ::YFP fusion proteins. In contrast, the HA759 model with strong expression of polyQ-expanded tracts in ASH neurons is used to examine neuronal death and chemoavoidance behavior. To comprehensively evaluate the neuroprotective capacity of target compounds, the above test results are ultimately presented as a radar chart with profiling of multiple phenotypes in a manner of direct comparison and direct viewing.

Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity

Here, we present a protocol to assess the neuroprotective activities of test compounds in Caenorhabditis elegans, including polyglutamine aggregation, neuronal death, and chemoavoidance behavior, as well as an exemplary integration of multiple phenotypes.

Caenorhabditis elegans como sistema modelo para descubrir compuestos bioactivos contra la neurotoxicidad mediada por poliglutamina

Age-related misfolding and aggregation of pathogenic proteins are responsible for several neurodegenerative diseases. For example, Huntington&#39;s ...

Neurociencias

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

La investigación de las proteínas priónicas, como la extensión y la toxicidad de Uso del Metazoan Organismo modelo<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Un rastreable<em&gt; En Vivo</em&gt; Ensayo para mitocondrial Moduladores Usando transgénico bioluminiscente<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

Cuantificación de la disminución proteostática específica del tejido en Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Uso de Caenorhabditis elegans para detectar interacciones de chaperonas específicas del tejido

Resumen

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Capítulos en este video

Un método Simple para la detección química de alto rendimiento en Caenorhabditis Elegans

Identificación de inhibidores de EGFR y RAS mediante Caenorhabditis elegans

Preparación de extractos de proteínas y co-inmunoprecipitación de Caenorhabditis elegans

Selección de alto rendimiento y biosensores fluorescentes con C. elegans Las cepas

Básico

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Caenorhabditis elegans como sistema modelo para descubrir compuestos bioactivos contra la neurotoxicidad mediada por poliglutamina

La investigación de las proteínas priónicas, como la extensión y la toxicidad de Uso del Metazoan Organismo modelo

Un rastreable

Cuantificación de la disminución proteostática específica del tejido en Caenorhabditis elegans