우리는 선충 균주의 일부에 대한 NIH 국립 연구 자원 센터 (NCRR)에 의해 투자 Caenorhabditis 유전학 센터에 감사드립니다. H.F. 엡스타인에 의해 개발된 단클론 항체는 NICHD의 후원하에 개발되고 아이오와 대학 생물학부에 의해 유지된 발달 연구 Hybridoma 은행에서 취득되었습니다. 이 연구는 이스라엘 과학 재단 (278/18) 및 이스라엘 과학 기술부및 외교 국제 협력부, 국가 진흥, 이탈리아 공화국 (제 3-14337 권부)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 벤-즈비 연구소 회원들에게 이 원고를 준비하는 데 도움을 주신 것에 감사드립니다.

1. RNAi에 대한 선충 성장 미디어 플레이트의 준비
<ol><li>1 L 병에는 NaCl 3 g, Bacto-Peptone 2.5 g, 17 g의 천및 증류수를 최대 1 L 및 오토클레이브에 추가하십시오.</li>
	<li>55 °C에 병을 냉각.</li>
	<li>1M KH2PO4,pH 6.0, 1 M CaCl2의1mL, 1 M MgSO4의1mL, 콜레스테롤 용액 1mL(표1)의25mL를 추가하여 선충 성장 미디어(NGM)를 만듭니다.</li>
	<li>1mL의 암피실린(100 mg/mL)과 0.5mL의 1M IPTG(표1)를추가하여 NGM-RNAi 용액을 만듭니다. 참고: 일반적으로 사용되는 HT115(DE3) 대장균 균에는 dsRNA-인코딩 플라스미드를 발현하는 데 사용되는 IPTG 유도가능한 T7 DNA 폴리머라아제가 함유되어 있습니다. 이 플라스미드는 또한 암피실린 저항을 위해 인코딩합니다.</li>
	<li>병을 소용돌이에 의해 따뜻한 용액을 섞는다.</li>
	<li>후드 또는 멸균 절차를 사용하여 NGM 용액을 플레이트에 붓거나 연동 펌프를 사용하여 용액을 플레이트에 분배합니다. 이 화면에 는 6웰, 12웰, 40mm 또는 60mm 플레이트를 사용합니다. 한천은 플레이트 깊이의 약 2/3을 채워야 합니다.</li>
	<li>접시를 실온에서 벤치에서 밤새 건조하게 하여 접시를 덮어 두십시오. RNAi용 NGM 플레이트는 최대 한 달 동안 4°C로 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>2. RNAi 박테리아를 재배하고 접시를 파종
<ol><li>후드 또는 멸균 절차를 사용 하 여, 암피실린의 1 mL를 추가 (100 mg/mL) 그리고 2.5 테트라 사이클린의 mL (5 mg/mL)(표 1)LB 용액의 사전 자동 1 L에. 참고: 일반적으로 사용되는 HT115(DE3) 대장균 박테리아는 테트라사이클린 내성입니다.</li>
	<li>후드 또는 멸균 절차를 사용하면 2mL 깊이96웰 멸균 플레이트에 각 웰에 600 μL의 LB 솔루션을 추가하십시오. 미디어를 분배하기 위해 멀티채널 파이펫을 사용하는 것이 가장 좋습니다.</li>
	<li>멸균 절차를 사용하여 HT115 (DE3) 대장균 박테리아로 굴절 된 우물은 dsRNA 인코딩 플라스미드로 변형되어 관심 있는 유전자 또는 빈 플라스미드를 대조군으로 선별합니다. 플레이트를 덮고 하룻밤 사이에 37°C에서 배양합니다. dsRNA를 발현하는 세균클론으로 구성된 라이브러리는, 예측된 C. elegans 유전자의 ~94%에 대응하는 이전에22,23을 시판하고 상용화되었다. 여기에 사용되는 샤페론 도서관은 박사 리처드 모리모토 연구소에 의해 건설되었다26.</li>
	<li>멸균 절차를 사용하여, 12-well, 40mm 및 6-well 또는 60mm NGM RNAi 플레이트에 박테리아의 종자 75, 150 또는 250 μL, 각각. 명확하게 플레이트에 대상 유전자의 이름을 표시합니다. 박테리아는 천 표면의 30-50 %를 커버해야하며 접시의 가장자리를 만지지 않아야합니다.</li>
	<li>플레이트가 실온에서 벤치에서 적어도 2일 동안 건조하여 접시를 덮어 두십시오. 참고 : 플레이트는 하룻밤 사이에 37 °C에서 배양 할 수 있습니다. 플레이트를 사용하거나 보관하기 전에 내부 우물이 건조한지 확인하십시오. 모든 장기적인 목적(즉, 건조 또는 보관)을 위해 플레이트를 어둠 속에서 유지합니다. 건조, 종자 플레이트는 최대 한 달 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 배아의 스트레스가 없는 동기화
<ol><li>웜 픽을 사용하여 동기화되지 않은 웜 플레이트에서 새로 시드된 NGM 플레이트로 약 100개의 달걀을 이동합니다.</li>
	<li>15°C에서 5일 동안, 20°C에서 3.5일 또는 25°C에서 2.5일 동안 동물을 재배한다. 동물은 계란 누워의 첫 날에 도달해야합니다. 참고: 벌레는 일반적으로 20°C에서 재배됩니다. 그러나, 상이한 보호자 돌연변이 균주는 특정 재배 온도를 요구할 수 있다. 예를 들어, 많은 온도 에 민감한 균주는 15 °C에서 재배되지만 표현형을 노출하기 위해 25 °C로 이동합니다.</li>
	<li>세균 잔디에서 천천히 멀리 M9 버퍼(표 1)의1 mL을 추가합니다. 버퍼가 플레이트를 완전히 덮도록 플레이트를 회전합니다. 그런 다음 한쪽으로 기울어 접시에서 액체를 제거하고 접시에서 동물을 씻어. 참고: 온도에 민감한 동물 이나 보호자 돌연변이를 사용 하는 경우, 동물의 재배 온도에서 프로토콜에 사용 되는 버퍼를 유지 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>3.3을 세 번 반복하거나 모든 동물이 접시에서 씻겨 나갈 때까지 반복하십시오.</li>
	<li>표준 플라스틱 팁을 사용하여 계란이 농축된 세척된 접시에서 한정된 천을 자르고 새로 시드된 NGM 플레이트에 한천 조각을 놓습니다. 참고 : ~ 200 계란은 충분한 계란 누워 동물을 생산하는 데 필요합니다; 너무 많은 동물이 너무 빨리 박테리아를 소비합니다. 낮은 식품 수준은프로테오스타증(27)에영향을 줄 수 있다.</li>
	<li>15°C에서 5일 동안, 20°C에서 3.5일 또는 25°C에서 2.5일 동안 동물을 재배한다. 이 시점에서 플레이트는 동기화된 계란으로 덮여 있어야 합니다. 참고: 동물을 더 엄격한 동기화를 위해 짧은 기간 동안 새 접시로 이동할 수 있습니다. 그러나, 동물이 동기화에 영향을 미치는 그들의 자궁에 있는 계란을 유지할 수 있기 때문에 계란 누워의 초기 단계에서 만 성인을 사용하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>세균 잔디에서 천천히 멀리 M9 버퍼의 1 mL을 추가합니다.</li>
	<li>버퍼가 플레이트를 완전히 덮도록 플레이트를 회전합니다. 그런 다음 한쪽으로 기울어 접시에서 액체를 제거하고 접시에서 동물을 씻어.</li>
	<li>3.7을 세 번 반복하거나 모든 동물이 접시에서 씻겨 나갈 때까지 반복하십시오.</li>
	<li>M9 버퍼 1mL을 추가하고 셀 스크레이퍼를 사용하여 접시에서 계란을 방출합니다.</li>
	<li>플레이트에서 계란을 포함하는 M9 버퍼를 수집합니다.</li>
	<li>2 분 동안 3,000 x g에서 계란을 포함하는 M9 버퍼 원심 분리.</li>
	<li>상체를 제거하고 M9 버퍼를 추가하여 1mL의 부피에 도달합니다.</li>
	<li>계란과 박테리아의 어떤 덩어리를 방해 하기 위해 계란을 다시 중단.</li>
	<li>3.11-3.13 단계에 설명된 세척 절차를 5회 반복한다. 달걀 펠릿은 흰색으로 표시되어야 합니다. 노란색/갈색이면 흰색 펠릿이 얻을 때까지 세척을 반복합니다. 참고: 계란에 남아 있는 박테리아는 dsRNA 표현 박테리아를 오염시킬 수 있습니다.</li>
	<li>대부분의 상체를 제거하여 약 200 μL을 남기고 RNAi 화면에 동기화된 계란을 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 일반적인 표형 에세이
<ol><li>실험 중 동물의 재배<ol>
<li>각 RNAi 시드 접시에 세균 잔디에 가까운 ~ 30 계란의 방울을 놓습니다. 참고로, 빈 벡터 함유(L4440) 박테리아로 시드된 접시에 ~30개의 알을 놓습니다.</li>
		<li>NGM RNAi 시드 플레이트에서 연령 동기화 동물을 육성합니다. 실험의 기간은 동물을 모니터링하는 단계와 재배 온도에 따라 달라집니다. 온도에 민감한 돌연변이 동물을 사용할 때 재배 온도를 조정합니다. 발달 지연 된 돌연변이 동물을 사용할 때 재배 기간을 조정합니다. 참고: 시기는 다를 수 있지만, 동물이 성인기에 도달하면 계란 누워 (그리고 그 결과로 급속한 음식 소비), 뿐만 아니라 연령에 따라 달라 둔 proteostsis 붕괴28,결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 계란 누워의 발병 전에 동물을 득점하는 것이 좋습니다 (성인의 일 1 일). 야생형 동물은 15°C에서 4.5일, 20°C에서 3일 또는 25°C에서 2일 후에 이 단계에 도달한다.</li>
		<li>사용된 반복의 수는 검토된 유전자 세트의 크기에 따라 달라집니다. 샤페론 라이브러리(97유전자)의 경우 실험을 적어도 4번 반복한다. 채우기의 크기는 사용되는 분석에 따라 다릅니다. 여기에서 논의된 행동 적 소에서, 각 반복에서 실험 조건 당 >15 동물을 점수. 데이터 및 통계 분석은 또한 사용되는 분석의 유형에 크게 의존합니다. 여기에 설명된 분석서의 데이터는 SEM을 ± 수단으로 제시될 수 있습니다.</li>
		<li>RNAi 및 빈 벡터 제어 처리 동물을 독립적인 인구로 비교합니다. P 값은 검사된 변경 사항, 즉 단독으로 또는 둘 다를 악화또는 완화하는 변경 사항에 따라 단방향 또는 양방향 ANOVA를 사용하여 계산할 수 있습니다. 단일 RNAi 처리 대 대조군을 검사할 때, P 값은 단방향 또는 양방향 Mann-Whitney 랭크 합계 시험을 사용하여 계산될 수 있습니다. 통계적 유의 이외에 표현형에 미치는 영향 정도에 따라 안타에 대한 임계값을 고려하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>발달 체포/지연<ol>
<li>빈 벡터 함유 대조군 박테리아에서 자란 동물이 성인기에 도달할 때까지 4.1 단계와 같이 나이 동기화 된 동물을 육성하지만 계란 누워가 시작되기 전에.</li>
		<li>스테레오 현미경을 사용하여 동물을 모니터링하고 애벌레와 성인의 수를 계산하여 발달 지연 된 동물의 백분율을 계산합니다. 참고로, 빈 벡터 함유 대조군 박테리아에서 자란 돌연변이 동물과 비교하십시오. hsp-1 또는 hsp-90 RNAi 치료는 야생 형 동물의 발달 체포를 초래하고 긍정적 인 제어로 사용될 수있다.</li>
		<li>시간이 지남에 따라 발달 지연 동물의 퍼센트를 득점하려면 4.2.2 단계를 반복하십시오. 참고: 접시에 계란 누워 성인이 있는 경우, 자손과의 혼동을 피하기 위해 동일한 표적 유전자에 표지된 새로운 NGM-RNAi 플레이트로 발달 지연된 동물을 이송합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>멸균 또는 계란 누워 결함<ol>
<li>빈 벡터 대조균에서 자란 동물이 알을 낳기 시작할 때까지 4.1 단계에서와 같이 노화 동기화 된 동물을 육성합니다.</li>
		<li>스테레오 현미경을 사용하여 동물을 모니터링하고 자궁에 눈에 보이는 계란이없는 동물의 퍼센트를 점수. 참고로 빈 벡터 제어 박테리아에서 자란 돌연변이 동물과 비교하십시오.</li>
		<li>또는, 스테레오 현미경을 사용하여 동물을 모니터링하고 EGg 누워 결함 (Egl-d) 표현형(29)으로정의 계란의 전체 자궁을 가진 동물의 퍼센트를 점수.</li>
	</ol></li>
	<li>배아 치사<ol>
<li>동물이 알을 낳기 시작할 때까지 4.1 단계에서와 같이 나이 동기화 된 동물을 육성합니다.</li>
		<li>~100개의 달걀을 빈 접시에 옮기습니다. 계란을 행으로 펴서 계산을 단순화합니다.</li>
		<li>24-48 시간 후에 접시에 해치지 않은 계란의 백분율을 점수. 참고로, 빈 벡터 대조균으로 치료된 동물의 알과 비교하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>마비 분석<ol>
<li>1일째 성인의 경우, 빈 벡터 대조균에서 자란 동물이 성기에 도달할 때까지 4.1단계와 같이 연령과 동기화된 동물을 육성하지만 계란 누워가 시작되기 전에 재배합니다.</li>
		<li>미세 마커를 사용하여 일반 NGM 한천 플레이트 뒷면에 선을 그립니다.</li>
		<li>표시된 줄에 5-10 마리의 동물을 배치합니다.</li>
		<li>타이머를 설정하고 10 분 기다립니다.</li>
		<li>마비 된 벌레로 라인에 남아있는 동물의 퍼센트를 점수. 참고로 빈 벡터 제어 박테리아에서 자란 돌연변이 동물과 비교하십시오. unc-45 RNAi로 처리된 야생형 동물은 심각한 마비 표현형을 나타내며 양성 대조군으로 사용될 수 있다. 참고 : 이 분석은 중증 마비에 중간을 보여주는 동물을 강조합니다. 이러한 동물들은 보통 일반적인 곡선 모양을 제시하기보다는 접시에 똑바로 놓여 있습니다. 또한, 마비 된 벌레의 머리 주위에 박테리아의 삭제 패치가 볼 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>스래싱 분석<ol>
<li>빈 벡터 대조균에서 자란 동물이 성인기에 도달할 때까지 4.1 단계와 같이 나이 동기화 된 동물을 육성하지만 계란 누워가 시작되기 전에.</li>
		<li>동물의 재배 온도에서 M9 버퍼의 파이프 100 μL을 96 웰 플레이트로 넣습니다.</li>
		<li>M9 버퍼 함유 우물에 잘 1개씩 - 15개의 웜을 배치합니다.</li>
		<li>동물이 5 분 동안 조정하자.</li>
		<li>스테레오 현미경아래 각 동물을 검사하고, 타이머가 15초 카운트다운되고, 각 동물이 해당 기간에 수행하는 신체 굴곡 수를 계산합니다. 계산된 값은 분당 바디 굽힘에 정규화할 수 있습니다. 참고로 빈 벡터 제어 박테리아에서 자란 돌연변이 동물과 비교하십시오. 참고 : 이 운동성 분석은 매우 민감하며 치료 사이의 매우 가벼운 차이를 감지 할 수 있습니다. 그러나, 액체의 운동성과 한천에 운동성 다를 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 단백질 녹다운 의 검증
<ol><li>관련 dsRNA-표현 또는 빈 벡터 함유(L4440) 박테리아와 시드된 60mm NGM-RNAi 플레이트에 250-300개의 동기화된 계란을 놓습니다. 참고: RNAi 녹다운은 배아의 비정상적인 축적, 배아 부족 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 발달 체포의 결과를 초래할 수 있습니다. 이것은 검사될 동물의 나이를 결정할 때 고려되어야 합니다.</li>
	<li>1일성인의 경우, 15°C에서 4.5일, 20°C에서 3일 또는 25°C에서 2일 동안 동물을 재배한다.</li>
	<li>총 200마리의 젊은 성인 동물을 1.5mL 튜브 의 캡에 PBS-T 200 μL로 선택하고 옮기. 참고: 온도에 민감한 동물 이나 보호자 돌연변이를 사용 하는 경우, 동물의 재배 온도에서 프로토콜에 사용 되는 버퍼를 유지 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>캡을 조심스럽게 닫고 원심분리기를 1,000 x g에서 1분 간 닫습니다.</li>
	<li>PBS-T(표1)및 원심분리기 800μL을 1분 동안 1,000 x g에 추가합니다.</li>
	<li>조심스럽게 상단 900 μL을 제거합니다.</li>
	<li>5.4-5.6 단계를 세 번 반복합니다.</li>
	<li>900 μL을 제거하여 200개의 웜을 포함하는 100μL의 용액을 남깁니다.</li>
	<li>5배 샘플버퍼(표 1)의25μL을 추가합니다.</li>
	<li>샘플을 92°C에서 10분 동안 가열하고 1000 rpm에서 흔들어 보입니다. 그런 다음 샘플을 동결하고 -20 °C로 보관 할 수 있습니다.</li>
	<li>각 샘플의 20 μL을 로드하고 SDS 페이지 젤에서 실행합니다.</li>
	<li>단백질의 상대적 안정성을 결정하기 위해 적절한 항체를 사용하여 서양 얼룩 분석을 수행합니다.</li>
	<li>자유롭게 사용할 수 있는 ImageJ 젤 모듈과 같은 밀도 측정 소프트웨어를 사용하여 대역의 강도를 결정합니다. 모든 값을 제어 샘플에서 측정된 값으로 정규화합니다. 참고: 우리의 화면에 RNAi 녹다운의 목표는 특정 보호자/ 공동 보호자의 단백질 수준을 낮추는 것입니다. 따라서, RNAi 녹다운의 효율을 평가하는 가장 좋은 방법은 서부 블롯 분석에 의한 것입니다. 이것은 특정 항체를 요구합니다. 또는 qPCR을 사용하여 mRNA 수준을 정량화할 수 있습니다.</li>
</ol>

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프로테오스타증 네트워크의 통합 된 그림은 어떻게 조직되고 다른 대사 세포및 조직에서 기능이 부족한지 반영합니다. 이러한 단점을 해결하기 위해서는 분자 보호자와 같은 이 네트워크의 다양한 구성 요소의 상호 작용에 대한 구체적인 정보가 개발 및 노화 과정에서 특정 조직에서 필요합니다. 여기에서, 우리는 조직 특정 동요의 사용이 주어진 조직에서 chaperone 네트워크를 검토하는 가능하게...

세포는 손상된 단백질1,2를수리, 격리 또는 제거하는 품질 관리 기계를 사용하여 단백질 손상에 대처한다. 단백질 복합체의 접이식 및 조립은 분자 보호자에 의해 지원되며, 손상된 단백질을 수리하거나 격리할 수 있는 다양한 보존된 단백질군3,4,5,6,7이지원된다. 손상된 단백질의 제거는 유비퀴틴-프로테솜 시스템(UPS)8 또는자가기계(9)에 의해 중재되어 샤페론10,11,12와공동으로 처리된다. 단백질 항상성(proteostasis)은, 따라서 접기 및 분해 기계로 구성된 품질 관리 네트워크에 의해 유지된다3,13. 그러나 생체 내에서 프로테오스타증 네트워크의 다양한 구성 요소 간의 상호 작용을 이해하는 것이 주요 과제입니다. 단백질 단백질 상호 작용 스크린은 물리적 상호 작용 및 보호자 복합체14,15에중요한 정보를 기여하는 동안, 생체 내의 조직 및 보상 메커니즘을 이해하는 것은 부족합니다.
유전 상호 작용은 종종 공통 또는 보상 생물학적 경로16,17,18에관여하는 유전자의 쌍 사이의 관계를 검사하는 강력한 도구로 사용됩니다. 이러한 관계는 돌연변이 쌍을 결합하고 제2유전자(16)의돌연변이에 의한 현상증 중증도에 대한 한 유전자의 돌연변이의 영향을 정량화함으로써 측정될 수 있다. 대부분의 이러한 조합은 표현형의 관점에서 어떤 효력도 보여주지 않지만, 몇몇 유전 상호 작용은 측정된 표현형의 엄격을 악화시키거나 완화할 수 있습니다. 이중 결실 돌연변이의 표현형이 단일 삭제 돌연변이를 결합할 때 볼 수 있는 예상 표현형보다 더 심각할 때, 두 유전자가 병렬 경로에서 기능한다는 것을 암시하는 경우, 함께 주어진 기능에 영향을 미치는 돌연변이가 관찰된다. 대조적으로, 이중 결실 돌연변이의 표현형이 단일 결실 돌연변이체로 보인 표현형보다 덜 심각할 때, 두 유전자가 복합체로 함께 작용하거나 동일한경로(16,18)에참여한다는 것을 암시하는 경우, 경감 돌연변이가 관찰된다. 이에 따라, 치사, 성장률 및 무리 크기와 같은 광범위한 표현형을 포함하여 정량화될 수 있는 다양한 표현형뿐만 아니라 전사 기자와 같은 특정 표현형이 유전적 상호 작용을 식별하는 데 사용되어 왔다. 예를 들어, Jonikas 등은 ER 스트레스 리포터에 의존하여 쌍방향 유전자 삭제 분석을 이용한 Saccharomyces cerevisiae ER 전개 단백질 반응 프로테오스타시스 네트워크의 상호 작용을검사한다.
유전 상호 작용 스크린은 이중돌연변이20의포괄적인 세트를 생성하기 위하여 체계적으로 쌍으로 삭제 돌연변이를 교차하는 관련시킵니다. 그러나 동물 모델, 특히 C. elegans에서는이 대규모 접근 방식이 실현 가능하지 않습니다. 대신, 돌연변이 균주는 RNA 간섭(RNAi)21을사용하여 유전자 발현을 다운 조절함으로써 그들의 유전 상호 작용 패턴을 위해 시험될 수 있다. C. elegans는 RNAi22,23을기반으로 한 스크린을 위한 강력한 시스템입니다. C. elegans에서,이중 좌초 RNA (dsRNA) 납품은 수많은 조직에 dsRNA 분자의 퍼짐으로 이끌어 내는 세균성 공급에 의해 달성됩니다. 이러한 방식으로, 도입된 dsRNA 분자는 신속하고 간단한절차(21)를통해 동물에 영향을 미친다. RNAi를 이용한 유전 상호 작용 스크린은, 그러므로, RNAi 도서관24를사용하여 유전자 또는 대부분의 C. elegans 코딩 유전자의 세트를 아래로 조절의 충격을 밝힐 수 있습니다. 이러한 화면에서, 관심있는 돌연변이의 동작에 영향을 미치지만 야생 형 변형은 모니터링되는 표현형의 잠재적 인 수정자(25)입니다. 여기서, 우리는 C. elegans에서조직 별 보호자 상호 작용을 체계적으로 매핑하기 위해 돌연변이와 RNAi 스크리닝의 조합을 적용합니다.

<table><tbody><tr><td>12-well-plates</td><td>SPL</td><td>BA3D16B</td><td></td></tr><tr><td>40 mm plates</td><td>Greiner Bio-one</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>60 mm plates</td><td>Greiner Bio-one</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>96 well 2 mL 128.0/85mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>780278</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Formedium</td><td>AGA03</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Formedium</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>Sigma</td><td>BO126-25G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Qimaging</td><td>q30548</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Amresco</td><td>0433-250G</td><td></td></tr><tr><td>Confocal</td><td>Leica</td><td>DM5500</td><td></td></tr><tr><td>Filter (0.22 &amp;micro;m)</td><td>Sigma</td><td>SCGPUO2RE</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ165FC</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Frutarom</td><td>2355519000024</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Formedium</td><td>367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Bio-Lab</td><td>001649029100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>22189-08-8</td><td>Gift from the Morimoto laboratory</td></tr><tr><td>Myosin MHC A (MYO-3) antibody</td><td>Hybridoma Bank</td><td>5-6</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>s-0751</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-Lab</td><td>001903029100</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Merck</td><td>61930705001730</td><td></td></tr><tr><td>Plate pouring pump</td><td>Integra</td><td>does it p920</td><td></td></tr><tr><td>RNAi Chaperone library</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>VWR Life Science</td><td>0837-500</td><td></td></tr><tr><td>&amp;szlig;-mercaptoethanol</td><td>Bio world</td><td>41300000-1</td><td></td></tr><tr><td>stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>64-75-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Bio-Lab</td><td>002009239100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions

단백질과 단백질 복합체의 올바른 접이식 및 조립은 세포 기능에 필수적입니다. 세포는 건강한 프로테오아질을 유지하기 위해 손상된 단백질을 정확하거나 격리하거나 제거하는 품질 관리 경로를 사용하여 세포 프로테오스타증을 보장하고 추가 단백질 손상을 방지합니다. 프로테오스타증 네트워크 내의 중복 기능으로 인해 다세포 유기체 인코딩 유전자에서 녹다운 또는 돌연변이를 사용하여 검출 가능한 표현형을 선별하면 대부분의 경우 사소한 또는 표현형이 검출되지 않습니다. 우리는 특정 기능에 필요한 보호자를 식별하고 따라서 표현형과 기능 사이의 격차를 해소하기 위한 표적 선별 전략을 개발했습니다. 특히, 우리는 RNAi 합성 상호 작용 스크린을 사용하여 새로운 보호자 상호 작용을 모니터링, 다운 다운 샤페론 발현, 한 번에 하나의 보호자, 보호자 - 인코딩 유전자에 돌연변이를 운반하거나 관심의 보호자를 과발 현현동물에서. 개별적으로 총 표현형이 없는 두 개의 보호자를 방해함으로써, 우리는 둘 다 혼란할 때 특정 표현형을 악화하거나 노출시키는 보호자를 식별할 수 있습니다. 우리는 이 접근법이 주어진 표현형과 관련되었던 단백질 또는 단백질 복합체의 접기를 조절하기 위하여 함께 작동하는 chaperones의 특정 세트를 확인할 수 있다는 것을 보여줍니다.

UNC-45의 온도 에 민감한 돌연변이를 사용하여 허용 또는 제한 적인 조건에서 상호 작용을 악화또는 완화하기 위해 각각 검사합니다. 근육 조립 및 유지 보수는 조직 별 보호자 상호 작용을 연구하는 효과적인 시스템을 제공합니다. 수축 근육의 기능적 단위인 사컴레는 구조 및 조절 단백질의 결정과 같은 배열을 제공합니다. 모터 단백질 미오신의 안정성과 수축 근육 사혜성의 두꺼?...

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Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

샤페론-샤페론과 샤페론 기판 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 온화한 돌연변이와 결합된 RNA 간섭을 사용하여 Caenorhabditis elegans에 있는 합성 상호 작용 스크린을 능력을 발휘하고 chaperones의 과잉 발현및 유기체 수준에서 조직 특정 단백질 기능 장애를 감시합니다.

조직별 샤페론 상호 작용을 위해 검사하기 위해 Caenorhabditis elegans를 사용

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

2.8K 조회수.  Ben-Gurion University of the Negev. 샤페론-샤페론과 샤페론 기판 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 온화한 돌연변이와 결합된 RNA 간섭을 사용하여 Caenorhabditis elegans에 있는 합성 상호 작용 스크린을 능력을 발휘하고 chaperones의 과잉 발현및 유기체 수준에서 조직 특정 단백질 기능 장애를 감시합니다.

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

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Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

연구

생화학

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in several diseases including cancer. The free-living nematode C. elegans possesses an evolutionary and functionally conserved EGFR-RAS-ERK MAP signal cascade which is central for the development of the vulva. Gain of function mutations in RAS homolog LET-60 and EGFR homolog LET-23 induce the generation of visible nonfunctional ectopic pseudovulva along the ventral body wall of these worms. Previously, the multivulval (Muv) phenotype in these worms has been shown to be inhibited by small chemical molecules. Here we describe a protocol for using the worm in a liquid-based assay to identify inhibitors that abolish the activities of EGFR and RAS proteins. Using this assay, we show R-fendiline, an indirect inhibitor of K-RAS, suppresses the Muv phenotype expressed in the let-60(n1046) and let-23(sa62) mutant worms. The assay is simple, inexpensive, is not time consuming to setup, and can be used as an initial platform for the discovery of anticancer therapeutics.

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The genetically tractable nematode Caenorhabditis elegans can be used as a simple and inexpensive model for drug discovery. Described here is a protocol to identify anticancer therapeutics that inhibit the downstream signaling of RAS and EGFR proteins.

Caenorhabditis elegans를 사용하여 EGFR 및 RAS 억제제의 식별

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

암 연구학

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or identification of new ones can provide invaluable information about the function of a protein of interest. Some of the traditional methods for extract preparation frequently require labor-intensive and time-consuming techniques. Here, a modified extract preparation protocol using a bead mill homogenizer and metal beads is described as a rapid alternative to traditional protein preparation methods. This extract preparation method is compatible with downstream co-immunoprecipitation studies. As an example, the method was used to successfully co-immunoprecipitate&#160;C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 and two known ALG-1 interactors: AIN-1, and HRPK-1. This protocol includes descriptions of animal sample collection, extract preparation, extract clarification, and protein immunoprecipitation. The described protocol can be adapted to test for interactions between any two or more endogenous, endogenously tagged, or overexpressed C. elegans proteins in a variety of genetic backgrounds.

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

This method describes a protocol for high-throughput protein extract preparation from Caenorhabditis elegans samples and subsequent co-immunoprecipitation.

카노르하비티스 예르간에서 단백질 추출물 제제 및 공동 면역 침전

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

발생학

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

형광등과 높은 처리량 검사 및 Biosensing C. 엘레간스 레인스

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

생물학

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity

Age-related misfolding and aggregation of pathogenic proteins are responsible for several neurodegenerative diseases. For example, Huntington&#39;s disease (HD) is principally driven by a CAG nucleotide repeat that encodes an expanded glutamine tract in huntingtin protein. Thus, the inhibition of polyglutamine (polyQ) aggregation and, in particular, aggregation-associated neurotoxicity is a useful strategy for the prevention of HD and other polyQ-associated conditions. This paper introduces generalized experimental protocols to assess the neuroprotective capacity of test compounds against HD using established polyQ transgenic Caenorhabditis elegans models. The AM141 strain is chosen for the polyQ aggregation assay as an age-associated phenotype of discrete fluorescent aggregates can be easily observed in its body wall at the adult stage due to muscle-specific expression of polyQ::YFP fusion proteins. In contrast, the HA759 model with strong expression of polyQ-expanded tracts in ASH neurons is used to examine neuronal death and chemoavoidance behavior. To comprehensively evaluate the neuroprotective capacity of target compounds, the above test results are ultimately presented as a radar chart with profiling of multiple phenotypes in a manner of direct comparison and direct viewing.

Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity

Here, we present a protocol to assess the neuroprotective activities of test compounds in Caenorhabditis elegans, including polyglutamine aggregation, neuronal death, and chemoavoidance behavior, as well as an exemplary integration of multiple phenotypes.

Caenorhabditis elegans는 Polyglutamine-mediated Neurotoxicity에 대한 생리 활성 화합물을 발견하기위한 모델 시스템으로서의

Age-related misfolding and aggregation of pathogenic proteins are responsible for several neurodegenerative diseases. For example, Huntington&#39;s ...

신경과학

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

후생 동물 모델 생물을 사용하여 확산 및 독성 프리온 같은 단백질을 조사<em&gt; C. 엘레</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Screenable<em&gt; 생체</em&gt; 형질 전환 발광 생물을 사용 미토콘드리아 변조기에 대한 분석<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

Caenorhabditis 예인단에서 조직 특정 전립선 성 감소를 정량화

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

조직별 샤페론 상호 작용을 위해 검사하기 위해 Caenorhabditis elegans를 사용

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