Este método permitirá a los investigadores evaluar la viabilidad celular independientemente de la función mitocondrial. Y es susceptible a los esfuerzos de detección de drogas de alto rendimiento. Esta técnica es rápida, precisa, económica y permite la determinación de la citotoxicidad de compuestos, incluyendo aquellos que deterioran la función mitocondrial en la mayoría de los tipos de células.
Este protocolo es fácil de realizar. Es importante prestar atención a la preparación de fármacos, condiciones de tratamiento y densidad celular para garantizar la precisión y validez experimentales. La demostración visual de este método es importante porque los pasos de adquisición de imágenes y análisis de imágenes pueden ser difíciles de recapitular, especialmente para los investigadores que tienen poca experiencia con Gen5 Software.
Comience por preparar soluciones de los compuestos de interés en la concentración deseada. Asegúrese siempre de mezclar los compuestos por vórtices a fondo. Para medir la citotoxicidad de un solo compuesto, prepare compuestos a una concentración final de 2X.
Si mide la citotoxicidad de las combinaciones de compuestos, prepárelas a una concentración final de 4 veces. Preparar sólo los controles de disolvente mezclando la misma cantidad de disolvente con el medio adecuado. Recoger las células en un tubo cónico de 15 mililitros y alícuota 10 microlitros de la suspensión celular.
Para la tinción azul de tripano, agregue 10 microlitros de 0.4%trypan azul a la alícuota y utilice un hemocitoómetro o contador de células para contar células viables e inviables. Células de pellets en el tubo de 15 mililitros a 200 veces G durante cinco minutos, luego aspirar o descampar el sobrenadante. Suspendemos el pellet celular en medios apropiados de ensayo a una densidad celular de tres veces 10 a las quintas células por mililitro.
Utilice una pipeta multicanal para sembrar 50 microlitros de suspensión celular en cada pozo de una placa de 96 pozos. Para ensayos de un solo compuesto, agregue 50 microlitros de solución compuesta 2X en cada pozo. Para pozos de control de disolventes, añada 15 microlitros de medios de ensayo que contengan el disolvente a una concentración de 2X.
Para ensayos combinados añadir 25 microlitros de cada uno de los compuestos 4X en cada pozo. Para pozos de control de un solo compuesto, añada 25 microlitros cada uno de la solución compuesta 4X y el medio de prueba. Asegúrese de que la concentración final de DMSO no exceda el 0,5% Para garantizar la reproducibilidad, añada medicamentos con las puntas de la pipeta que toquen el lado de los pozos.
Tener cuidado de agregar los medicamentos a diferentes lugares. Estas puñaladas deben realizarse muy rápidamente, preferiblemente tomando no más de 30 minutos por placa. Toque suavemente la placa para mezclar el contenido de los pozos e incubarlo a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono.
Cuando esté listo para manchar las células con Hoechst 33342 y yoduro propidium, prepare una solución de tinción fresca 10X y agregue 10 microlitros a cada pozo. Toque suavemente la placa y cúlíquela a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Centrifugar la placa a 200 veces G durante cuatro minutos para llevar todas las células a la parte inferior de la placa.
A continuación, limpie cuidadosamente la parte inferior de la placa con una toallita húmeda de laboratorio para eliminar los desechos que puedan interferir con las imágenes. Imagen de la placa dentro de los 15 minutos después de la centrifugación. Abra Gen5 Software y cree un nuevo protocolo estándar, haga clic en Procedimiento y elija el tipo de placas que desea utilizar.
Por lo general, 96 placas de plástico negro bien. A continuación, establezca el método de lectura en image, haga clic en Okay y elija DAPI y Texas Red Filter sets con un objetivo de ampliación 4X. No se necesita ningún desplazamiento, ya que los centros de pozos serán puestos en la imagen.
Para el filtro DAPI, establezca el LED en 10, el tiempo de integración en 99 y la ganancia en cero. Para Texas Red, establezca el LED en ocho, el tiempo de integración en 950 y la ganancia en 18. Haga clic en Opciones para asegurarse de que el foco automático se realiza en el canal DAPI y no hay ningún desplazamiento en el enfoque entre canales.
Guarde el protocolo haciendo clic en Aceptar. Ahora las imágenes se pueden grabar con el botón Leer nuevo. Una vez grabadas las imágenes, haga clic en Reducción de datos y elija Preprocesamiento de imagen.
Aplique el preprocesamiento de imagen con resta de fondo oscuro utilizando el tamaño de aplanado automático basado en la señal DAPI. Para Texas Red, utilice las mismas opciones que para canal 1. Cuando haya terminado, haga clic en Aceptar.
Luego vaya al panel de análisis celular y aplique una máscara nuclear basada en la señal DAPI transformada con un valor umbral de 6.000 unidades, un tamaño de objeto mínimo de cinco micrómetros y un tamaño máximo de objeto de 25 micrómetros. Analice toda la imagen, excluya los objetos de borde primarios en el borde de la imagen y divida los objetos que se tocan. En las opciones de detección avanzadas, establezca el diámetro de la bola rodante como 30 micrómetros y evalúe el fondo en función del 5% de los píxeles más bajos.
Mantenga solo el recuento de celdas en métricas calculadas. Después de eso, realice un análisis de subpoblación basado en la señal roja de Texas transformada en la media con un valor umbral de 5.000 unidades para contar celdas muertas. Por último, acceda a los recuentos de celdas resultantes.
Aquí se muestran imágenes representativas de células manchadas con Hoechst, yoduro propidium. El número total de células es razonablemente alto y mayor que el número de células muertas. Cuando se comparó un panel de ensayos de citotoxicidad con la exclusión azul tripano, se encontró que MTT y los ensayos azules de Alamar midieron inexactamente la viabilidad celular.
Estos ensayos basados en enzimas mitocondriales mostraron una viabilidad significativamente menor en comparación con la exclusión azul de tripano. La tinción dual con Hoechst 33342 y PI tenía la mejor combinación de robustez, sensibilidad y consistencia con la tinción azul de tripano y la desviación mediana más pequeña del método de exclusión azul de tripano después del tratamiento con CCP o 2 DG. El ensayo Hoechst PI también fue eficaz para determinar la viabilidad celular después del tratamiento con las mitocondrias dirigidas a moléculas de Rotenone y tres bromopiruvato.
Fue validado con un panel de líneas celulares de leucemia. Estas células variaron en sensibilidad a la rotenona que van desde muy sensibles a las células de resistencia. El rendimiento incorrecto del ensayo puede comprometer su precisión.
Aquí se muestran varios resultados comprometidos. La sobremantación con PI, el descuido de la etapa de centrifugación, o la sobreexposición en el canal Hoechst, causará resultados subóptimos. Mientras cronometra este protocolo, recuerde optimizar la concentración del tinte y el tiempo de tinción para cada línea celular.
Además, la centrificación de una placa de muestra, es necesaria para garantizar la calidad de la imagen. Después de la identificación de compuestos del efecto de citotoxicidad en las células cancerosas, los investigadores pueden proceder con estudios mecánicos para identificar sus objetivos relevantes. El cribado de bibliotecas de moléculas pequeñas con esta técnica en paralelo a los ensayos convencionales de MTT, permitirá identificar rápidamente las moléculas que apuntan a la función mitocondrial.
