Cette méthode permettra aux chercheurs d’évaluer la viabilité cellulaire indépendamment de la fonction mitochondriale. Et il est possible d’obtenir des efforts de dépistage de drogues à haut débit. Cette technique est rapide, précise, peu coûteuse, et permet la détermination des composés cytotoxicité, y compris ceux qui altèrent la fonction mitochondrique dans la plupart des types de cellules.
Ce protocole est facile à exécuter. Il est important de prêter attention à la préparation des médicaments, aux conditions de traitement et à la densité cellulaire afin d’assurer l’exactitude et la validité expérimentales. La démonstration visuelle de cette méthode est importante parce que les étapes d’acquisition d’image et d’analyse d’image peuvent être difficiles à récapituler, en particulier pour les chercheurs ayant peu d’expérience avec Gen5 Software.
Commencez par préparer des solutions des composés d’intérêt à la concentration désirée. Assurez-vous toujours de mélanger les composés en vortexant soigneusement. Pour mesurer la cytotoxicité d’un seul composé, préparer les composés à une concentration finale de 2 X.
Si vous mesurez la cytotoxicité des combinaisons composées, préparez-les à une concentration finale 4X. Préparez les commandes de solvant seulement en mélangeant la même quantité de solvant avec le milieu approprié. Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et aliquot 10 microlitres de la suspension cellulaire.
Pour la coloration bleue trypan, ajouter 10 microlitres de 0,4% de bleu trypan à l’aliquot et utiliser un hémocytomètre ou un compteur cellulaire pour compter les cellules viables et non viables. Les cellules de granulés dans le tube de 15 millilitres à 200 fois G pendant cinq minutes, puis aspirer ou décamper le supernatant. Nous suspendons la pastille cellulaire dans l’essai des médias appropriés à une densité cellulaire de trois fois 10 à la cinquième cellule par millilitre.
Utilisez une pipette multicanal pour ensemencer 50 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de puits de 96. Pour les analyses composées simples, ajouter 50 microlitres de solution composée 2X dans chaque puits. Pour les puits de contrôle des solvants, ajouter 15 microlitres de supports d’essai contenant le solvant à concentration de 2 X.
Pour les analyses combinées ajouter 25 microlitres de chacun des composés 4X dans chaque puits. Pour les puits de contrôle composés simples, ajouter 25 microlitres chacun de solution composée 4X et milieu d’essai. Assurez-vous que la concentration finale de DMSO ne dépasse pas 0,5 % Pour assurer la reproductibilité, ajoutez des médicaments avec les pointes de pipette touchant le côté des puits.
Prendre soin d’ajouter les médicaments à différents endroits. Ces coups de couteau doivent être effectués très rapidement, de préférence en ne prenant pas plus de 30 minutes par plaque. Appuyez doucement sur la plaque pour mélanger le contenu des puits et l’incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.
Lorsqu’ils sont prêts à tacher les cellules avec Hoechst 33342 et propidium iodure préparer fraîche solution de coloration 10X et ajouter 10 microlitres à chaque puits. Appuyez doucement sur la plaque et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Centrifuger la plaque à 200 fois G pendant quatre minutes pour amener toutes les cellules au fond de la plaque.
Essuyez ensuite soigneusement le fond de la plaque à l’aide d’un lingette humide de laboratoire pour enlever les débris qui pourraient interférer avec l’imagerie. Imagez la plaque dans les 15 minutes suivant la centrifugation. Ouvrez gen5 Software et créez un nouveau protocole standard, cliquez sur Procédure et choisissez le type de plaques à utiliser.
Habituellement, 96 plaques de plastique bien noir. Ensuite, définissez la méthode de lecture à l’image, cliquez sur Ok, et choisissez DAPI et Texas Red Filter ensembles avec un objectif de grossissement 4X. Aucun décalage n’est nécessaire, puisque les centres de puits seront photographiés.
Pour le filtre DAPI, réglez la LED à 10, le temps d’intégration à 99, et gagnez à zéro. Pour Texas Red, réglez la LED à huit, le temps d’intégration à 950, et le gain à 18. Cliquez sur Options pour vous assurer que l’accent automatique est effectué sur le canal DAPI et il n’y a pas de décalage dans la focalisation entre les canaux.
Enregistrez le protocole en cliquant sur Okay. Maintenant, les images peuvent être enregistrées à l’aide du bouton Lire nouveau. Une fois les images enregistrées, cliquez sur Réduction de données et choisissez le prétraitement de l’image.
Appliquez le prétraitement d’image avec la soustraction foncée de fond utilisant la taille d’aplatissement automatique basée sur le signal de DAPI. Pour Texas Red, utilisez les mêmes options que pour Channel 1. Une fois terminé, cliquez sur Ok.
Ensuite, allez au panneau d’analyse cellulaire et appliquez un masque nucléaire basé sur le signal DAPI transformé d’une valeur seuil de 6 000 unités, une taille minimale d’objet de cinq micromètres et une taille maximale d’objet de 25 micromètres. Analyser l’image entière, exclure les objets de bord primaire à la limite de l’image et diviser les objets touchants. Dans les options avancées de détection, réglez le diamètre de la boule roulante sous forme de 30 micromètres et évaluez l’arrière-plan en fonction de 5 % des pixels les plus bas.
Ne gardez le nombre de cellules que dans les mesures calculées. Après ça, effectuez une analyse de sous-population basée sur le signal rouge du Texas transformé moyen avec une valeur seuil de 5000 unités pour compter les cellules mortes. Enfin, accédez au nombre de cellules qui en résulte.
Des images représentatives de cellules tachées de Hoechst, d’iodure de propidium sont montrées ici. Le nombre total de cellules est raisonnablement élevé et supérieur au nombre de cellules mortes. Quand un panneau des essais de cytotoxicité a été comparé à l’exclusion bleue de trypan, il a été constaté que MTT et les essais bleus d’Alamar ont inexactement mesuré la viabilité cellulaire.
Ces analyses mitochondriques à base d’enzymes ont montré une viabilité significativement plus faible par rapport à l’exclusion bleue trypan. La double coloration avec Hoechst 33342 et PI a eu la meilleure combinaison de robustesse, de sensibilité, et de cohérence avec la coloration bleue de trypan et la plus petite déviation médiane de la méthode bleue d’exclusion de trypan après traitement de CCP ou de 2-DG. L’essai hoechst PI a également été efficace pour déterminer la viabilité cellulaire après le traitement avec les mitochondries ciblant les molécules Rotenone et trois bromopyruvate.
Il a été validé par un panel de lignées de cellules leucémiques. Ces cellules ont varié dans la sensibilité de Rotenone s’étendant de très sensible aux cellules de résistance. Une mauvaise exécution de l’essai peut compromettre son exactitude.
Plusieurs résultats compromis sont montrés ici. La surstaining avec PI, négligeant l’étape de centrifugation, ou surexposition dans le canal de Hoechst, causera des résultats sous-optimaux. Lors du chronométrage de ce protocole, n’oubliez pas d’optimiser la concentration de colorant et le temps de coloration pour chaque lignée cellulaire.
En outre, centrification pour une plaque d’échantillon, est nécessaire pour assurer la qualité de l’imagerie. Après identification des composés de l’effet de cytotoxicité sur les cellules cancéreuses, les chercheurs peuvent procéder à des études mécanistes pour identifier leurs cibles pertinentes. Le criblage des bibliothèques de petites molécules avec cette technique en parallèle aux analyses conventionnelles de MTT, permettra d’identifier rapidement les molécules qui ciblent la fonction mitochondrique.
