Questo metodo consentirà ai ricercatori di valutare la vitalità cellulare indipendentemente dalla funzione mitocondriale. Ed è suscettibile di sforzi di screening dei farmaci ad alta produttività. Questa tecnica è veloce, accurata, economica e consente la determinazione dei composti citotossicità, compresi quelli che compromettono la funzione mitocondriale nella maggior parte dei tipi di cellule.
Questo protocollo è facile da eseguire. È importante prestare attenzione alla preparazione del farmaco, alle condizioni di trattamento e alla densità cellulare per garantire accuratezza e validità sperimentali. La dimostrazione visiva di questo metodo è importante perché i passaggi di acquisizione e analisi delle immagini possono essere difficili da ricapitolare, specialmente per i ricercatori che hanno poca esperienza con Gen5 Software.
Iniziare preparando soluzioni dei composti di interesse alla concentrazione desiderata. Assicurarsi sempre di mescolare accuratamente i composti vortice. Per misurare la citotossicità di un singolo composto, preparare composti a concentrazione finale 2X.
Se si misura la citotossicità delle combinazioni composte, prepararle a una concentrazione finale 4X. Preparare i controlli del solvente solo mescolando la stessa quantità di solvente con il mezzo appropriato. Raccogliere le cellule in un tubo conico da 15 millilitri e aliquota 10 microlitri della sospensione cellulare.
Per la colorazione blu tripano, aggiungere 10 microlitri dello 0,4% di tripano blu all'aliquota e utilizzare un emocitometro o un contatore di celle per contare cellule vitali e non vitali. Le celle a pellet nel tubo da 15 millilitri a 200 volte G per cinque minuti, quindi aspirano o decampano il supernatante. Sospendiamo il pellet cellulare in un saggio appropriato media ad una densità cellulare di tre volte 10 alla quinta cella per millilitro.
Utilizzare una pipetta multicanale per seminare 50 microlitri di sospensione cellulare in ogni pozzo di una piastra di 96 pozza. Per i test composti singoli, aggiungere 50 microlitri di soluzione composta 2X in ogni pozzo. Per i pozzi di controllo del solvente, aggiungere 15 microlitri di supporti di prova contenenti il solvente a concentrazione 2X.
Per i test combinati aggiungere 25 microlitri di ciascuno dei composti 4X in ogni pozzo. Per i pozzi di controllo composti singoli, aggiungere 25 microlitri ciascuno di soluzione composta 4X e mezzo di prova. Assicurarsi che la concentrazione finale di DMSO non superi lo 0,5%Per garantire la riproducibilità, aggiungere farmaci con le punte della pipetta che toccano il lato dei pozzi.
Fare attenzione ad aggiungere i farmaci in luoghi diversi. Queste macchie devono essere eseguite molto rapidamente, preferibilmente non richiedendo più di 30 minuti per piastra. Toccare delicatamente il piatto per mescolare il contenuto dei pozzi e incubarlo a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Quando è pronto a macchiare le cellule con Hoechst 33342 e propidio ioduro preparare una soluzione di colorazione fresca 10X e aggiungere 10 microlitri ad ogni pozzo. Toccare delicatamente il piatto e incubarlo a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Centrifugare la piastra a 200 volte G per quattro minuti per portare tutte le cellule sul fondo della piastra.
Quindi pulire con cura il fondo della piastra con una salvietta da laboratorio umida per rimuovere eventuali detriti che potrebbero interferire con l'imaging. Immagine della piastra entro 15 minuti dalla centrifugazione. Aprire Gen5 Software e creare un nuovo protocollo standard, fare clic su Procedura e scegliere il tipo di piastre da utilizzare.
Di solito, 96 piastre di plastica ben nere. Impostare quindi il metodo di lettura sull'immagine, fare clic su Ok e scegliere Set di filtri rossi DAPI e Texas con un obiettivo di ingrandimento 4X. Non è necessario alcun offset, poiché i centri del pozzo verranno imageati.
Per il filtro DAPI, impostare LED su 10, tempo di integrazione su 99 e guadagno su zero. Per Texas Red, imposta il LED a otto, il tempo di integrazione a 950 e il guadagno a 18. Fare clic su Opzioni per assicurarsi che lo stato attivo automatico sia eseguito sul canale DAPI e che non vi sia alcun offset nella messa a fuoco tra i canali.
Salvare il protocollo facendo clic su Ok. Ora le immagini possono essere registrate utilizzando il pulsante Leggi nuovo. Una volta registrate le immagini, fare clic su Riduzione dati e scegliere Pre-elaborazione immagini.
Applicare la pre-elaborazione delle immagini con sottrazione di sfondo scura utilizzando la dimensione di appiattimento automatico in base al segnale DAPI. Per Texas Red, usa le stesse opzioni di Channel 1. Al termine, fare clic su Ok.
Quindi vai al pannello di analisi cellulare e applica una maschera nucleare basata sul segnale DAPI trasformato con un valore di soglia di 6.000 unità, una dimensione minima dell'oggetto di cinque micrometri e una dimensione massima dell'oggetto di 25 micrometri. Analizzare l'intera immagine, escludere gli oggetti bordo primario sul bordo dell'immagine e dividere gli oggetti toccanti. Nelle opzioni di rilevamento avanzate, impostare il diametro della palla rotante su 30 micrometri e valutare lo sfondo in base al 5% dei pixel più bassi.
Mantenere il conteggio delle celle solo nelle metriche calcolate. Successivamente, eseguire un'analisi della sottopopolazione basata sul segnale rosso del Texas trasformato medio con un valore di soglia di 5.000 unità per contare le cellule morte. Infine, accedere al conteggio delle celle risultante.
Qui sono mostrate immagini rappresentative di cellule macchiate di Hoechst, ioduro di propidio. Il numero totale di cellule è ragionevolmente alto e maggiore del numero di cellule morte. Quando un pannello di test di citotossicità è stato confrontato con l'esclusione blu del tripano, è stato scoperto che MTT e il blu alamar dicono che la vitalità cellulare misurata in modo impreciso.
Questi saggi a base enzimatica mitocondriale hanno mostrato una vitalità significativamente inferiore rispetto all'esclusione blu del tripano. La doppia colorazione con Hoechst 33342 e PI ha avuto la migliore combinazione di robustezza, sensibilità e coerenza con la colorazione blu tripano e la più piccola deviazione mediana dal metodo di esclusione blu del trypan dopo il trattamento CCP o 2-DG. Il saggio hoechst PI è stato anche efficace nel determinare la vitalità cellulare dopo il trattamento con i mitocondri che prendono di mira le molecole Rotenone e tre bromopiruvati.
È stato ulteriormente convalidato con un pannello di linee cellulari di leucemia. Queste cellule variavano nella sensibilità di Rotenone che variava da cellule molto sensibili a cellule di resistenza. Prestazioni improprie del saggio possono comprometterne l'accuratezza.
Qui vengono mostrati diversi risultati compromessi. Il sovrasfrutto con PI, trascurando la fase di centrifugazione o la sovraesposizione nel canale Hoechst, causerà risultati non ottimali. Durante la tempistica di questo protocollo, ricordarsi di ottimizzare la concentrazione del colorante e il tempo di colorazione per ogni linea cellulare.
Inoltre, la centrificazione per una piastra campione è necessaria per garantire la qualità dell'imaging. Dopo l'identificazione dei composti dell'effetto citotossicità sulle cellule tumorali, i ricercatori possono procedere con studi meccanicistici per identificare i loro obiettivi pertinenti. Lo screening di piccole librerie di molecole con questa tecnica in parallelo ai saggi MTT convenzionali, consentirà di identificare rapidamente le molecole che prendono di mira la funzione mitocondriale.
