Этот метод позволит исследователям оценить клеточную жизнеспособность независимо от митохондриальной функции. И это подеспособно к высокой пропускной способности усилий по скринингу наркотиков. Этот метод является быстрым, точным, недорогим, и позволяет определить цитотоксичность соединений, в том числе тех, которые ухудшают митохондриальную функцию в большинстве типов клеток.
Этот протокол прост в работе. Важно обратить внимание на препарат, условия лечения и плотность клеток, чтобы обеспечить экспериментальную точность и действительность. Визуальная демонстрация этого метода важна, потому что шаги по захвату изображений и анализу изображений может быть трудно резюмировать, особенно для исследователей, имеющих небольшой опыт работы с Gen5 Software.
Начните с подготовки решений соединений, представляющих интерес при желаемой концентрации. Всегда убедитесь, что смешивать соединения путем вихрей тщательно. Для измерения цитотоксии одного соединения подготовьте соединения при конечной концентрации 2X.
При измерении цитотоксии комбинаций соединений, подготовить их в 4X окончательной концентрации. Подготовка растворителя только контролирует, смешивая такое же количество растворителя с соответствующей среде. Соберите клетки в 15 миллилитровую коническую трубку и aliquot 10 микролитров клеточной подвески.
Для трипан синий окрашивания, добавить 10 микролитров 0,4%trypan синий алицито и использовать гемоцитометр или счетчик клеток для подсчета жизнеспособных и не жизнеспособных клеток. Пеллетные клетки в 15 миллилитровой трубке по 200 раз G в течение пяти минут, затем аспират или decamped супернатант. Мы приостанавливаем гранулы клеток в эссе соответствующих средств массовой информации при плотности клеток в три раза от 10 до пятой клетки на миллилитр.
Используйте многоканарный пипетку, чтобы посеять 50 микролитров клеточной подвески в каждый колодец из 96 пластины. Для анализа одного соединения добавьте в каждую колодец 50 микролитров раствора соединения 2X. Для растворителей контрольных скважин добавьте 15 микролитров испытательных средств, содержащих растворитель при концентрации 2X.
Для комбинированных анализов добавьте 25 микролитров каждого из соединений 4X в каждую колодец. Для одной из скважин управления соединения добавьте 25 микролитров каждый из 4X соединения раствора и испытания среды. Убедитесь, что окончательная концентрация DMSO не превышает 0,5%, чтобы обеспечить воспроизводимость, добавьте препараты с пипеткой советы касаясь стороны скважин.
Будьте осторожны, чтобы добавить наркотики в разных местах. Это удары должны быть выполнены очень быстро, предпочтительно не более 30 минут на тарелку. Аккуратно коснитесь пластины, чтобы смешать содержимое колодцев и инкубировать его при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе.
Когда готовы окрашивать клетки с Hoechst 33342 и йодид пропидия подготовить свежий 10X окрашивания раствор и добавить 10 микролитров к каждой хорошо. Аккуратно коснитесь пластины и инкубировать ее при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут. Центрифуга пластины в 200 раз G в течение четырех минут, чтобы принести все клетки в нижней части пластины.
Затем тщательно протрите дно пластины влажной лабораторной салфеткой, чтобы удалить любые обломки, которые могут помешать визуализации. Изображение пластины в течение 15 минут после центрифугации. Откройте Программное обеспечение Gen5 и создайте новый стандартный протокол, нажмите на процедуру и выберите тип пластин, которые будут использоваться.
Как правило, 96 хорошо черные пластиковые пластины. Затем установите метод чтения на изображение, нажмите Ok и выберите наборы DAPI и Texas Red Filter с целью увеличения 4X. Нет смещения не требуется, так как хорошо центры будут изображены.
Для фильтра DAPI установите светодиод до 10, время интеграции до 99 и получите ноль. Для Texas Red, установить светодиод до восьми, время интеграции до 950, и получить до 18. Нажмите на Параметры, чтобы убедиться, что авто фокус выполняется на канале DAPI и нет смещения в фокусировке между каналами.
Сохраните протокол, нажав Ok. Теперь изображения можно записываеть с помощью кнопки Read New. После записи изображений нажмите на сокращение данных и выберите предварительную обработку изображений.
Применить предобработку изображения с вычитанием темного фона с использованием автоматического выравнивания размера на основе сигнала DAPI. Для Texas Red используйте те же опции, что и для Первого канала. Когда закончите, нажмите Хорошо.
Затем перейдите к панели клеточного анализа и примените ядерную маску на основе преобразованного сигнала DAPI с пороговым значением 6000 единиц, минимальным размером объекта в пять микрометров и максимальным размером объекта 25 микрометров. Проанализируйте все изображение, исключите первичные объекты края на границе изображения и разделите трогательные объекты. В расширенных вариантах обнаружения установите диаметр подвижного шара в 30 микрометров и оцените фон на основе 5% самых низких пикселей.
Храните только количество ячеей в рассчитанных метриках. После этого выполните анализ субпопуляции на основе среднего преобразованного техасского красного сигнала с пороговым значением 5 000 единиц для подсчета мертвых ячеек. Наконец, доступ к полученной ячейке рассчитывает.
Здесь показаны репрезентативные изображения клеток, окрашенных Хёхстом, йодидом пропидия. Общее количество клеток достаточно высокое и больше, чем количество мертвых клеток. Когда группа анализов цитотоксии была сравнена с trypan синим исключением, было установлено, что MTT и Alamar синий анализы неточно измеряется клеточной жизнеспособности.
Эти митохондриальные ферментные анализы показали значительно более низкую жизнеспособность по сравнению с трипан-голубым исключением. Двойное окрашивание с Hoechst 33342 и PI было лучшее сочетание надежности, чувствительности и последовательности с трипан синий окрашивания и малейшего медианного отклонения от метода trypan синий исключение после CCP или 2-DG лечения. Эссе Hoechst PI также было эффективным в определении клеточной жизнеспособности после лечения митохондриями, нацеленными на молекулы Rotenone и три бромопирувате.
Кроме того, он был проверен с помощью панели линий клеток лейкемии. Эти клетки варьировались в чувствительности Ротенона, начиная от очень чувствительных к клеткам сопротивления. Неправильная производительность анализа может поставить под угрозу его точность.
Здесь показано несколько скомпрометированных результатов. Переутомление с ИП, пренебрежение шаг центрифугации, или чрезмерное воздействие в канале Hoechst, приведет к неоптимальным результатам. Хотя сроки этого протокола, не забудьте оптимизировать концентрацию красителя и время окрашивания для каждой линии клеток.
Кроме того, для обеспечения качества изображения необходима центрификация образцовой пластины. После выявления соединений цитотоксичности влияние на раковые клетки, исследователи могут приступить к механистическим исследованиям для выявления их соответствующих целей. Скрининг небольших библиотек молекул с этой техникой параллельно с обычными анализами МТТ позволит быстро идентифицировать молекулы, нацеленные на митохондриальную функцию.
