هذه الطريقة سوف تسمح للباحثين لتقييم صلاحية الخلوية بشكل مستقل عن وظيفة الميتوكوندريا. وهو قابل لارتفاع إنتاجية جهود فحص المخدرات. هذه التقنية سريعة ودقيقة وغير مكلفة، وتسمح بتحديد المركبات السمية الخلوية، بما في ذلك تلك التي تضعف وظيفة الميتوكوندريا في معظم أنواع الخلايا.
هذا البروتوكول سهل الأداء. من المهم أن تولي اهتماما لإعداد المخدرات، وظروف العلاج، وكثافة الخلايا لضمان دقة التجريبية وصلاحية. إن العرض التوضيحي المرئي لهذه الطريقة مهم لأن خطوات الحصول على الصور وتحليل الصور قد يكون من الصعب تلخيصها ، خاصة بالنسبة للباحثين الذين لديهم خبرة قليلة مع Gen5 Software.
تبدأ من خلال إعداد حلول للمركبات ذات الأهمية في التركيز المطلوب. تأكد دائما من خلط المركبات عن طريق دوامة تماما. لقياس السمية الخلوية لمركب واحد، قم بإعداد المركبات عند التركيز النهائي 2X.
إذا كان قياس السمية الخلوية من مجموعات مركبة، وإعدادها في تركيز نهائي 4X. إعداد المذيبات فقط عن طريق خلط نفس الكمية من المذيبات مع المتوسطة المناسبة. جمع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر و aliquot 10 ميكرولترات من تعليق الخلية.
لتلطّيخ الأزرق trypan، إضافة 10 ميكرولترات من 0.4٪ trypan الأزرق إلى aliquot واستخدام عداد الهيموسيت أو عداد الخلية لحساب الخلايا القابلة للحياة وغير قابلة للحياة. خلايا بيليه في أنبوب 15 ملليلتر في 200 مرة G لمدة خمس دقائق، ثم الpirate أو decamped ناضح. نحن تعليق بيليه الخلية في وسائل الإعلام مقال المناسبة في كثافة الخلية من ثلاث مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر.
استخدام ماصة متعددة القنوات لذرة 50 ميكرولترات من تعليق الخلية في كل بئر من 96 لوحة جيدا. بالنسبة للمحسّات المركبة الواحدة، أضف 50 ميكرولترات من محلول مركب 2X في كل بئر. بالنسبة لآبار التحكم بالمذيبات، أضف 15 ميكرولترات من وسائط الاختبار التي تحتوي على المذيبات بتركيز 2X.
لمحسانات الجمع إضافة 25 ميكرولترات من كل من المركبات 4X في كل بئر. بالنسبة لآبار التحكم في المركبات الفردية، أضف 25 ميكرولترات لكل من حل مركب 4X ومتوسط الاختبار. تأكد من أن التركيز النهائي لـ DMSO لا يتجاوز 0.5٪ لضمان قابلية التكاثر ، أضف الأدوية مع نصائح الماصات التي تلمس جانب الآبار.
الحرص على إضافة الأدوية إلى مواقع مختلفة. يجب إجراء هذه الطعنات بسرعة كبيرة ، ويفضل أن لا تستغرق أكثر من 30 دقيقة لكل لوحة. اضغط بلطف على اللوحة لخلط محتويات الآبار واحتضانها عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
عندما تكون على استعداد لطخة الخلايا مع Hoechst 33342 وروبوديوم يوديد إعداد جديدة 10X تلطيخ حل وإضافة 10 ميكرولترات لكل بئر. اضغط بلطف على اللوحة واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. جهاز طرد مركزي في لوحة 200 مرة G لمدة أربع دقائق لجلب جميع الخلايا إلى الجزء السفلي من لوحة.
ثم مسح بعناية الجزء السفلي من لوحة مع مسح مختبر رطب لإزالة أي حطام التي قد تتداخل مع التصوير. صورة لوحة في غضون 15 دقيقة بعد الطرد المركزي. فتح Gen5 البرمجيات وإنشاء بروتوكول جديد قياسي، انقر على الإجراءات واختيار نوع من لوحات لاستخدامها.
عادة، 96 لوحات بلاستيكية سوداء جيدا. بعد ذلك، قم بتعيين طريقة القراءة إلى الصورة، انقر فوق "حسناً"، ثم اختر مجموعات DAPI و تكساس ريد تصفية مع هدف تكبير 4X. لا حاجة إلى تعويض ، حيث سيتم تصوير مراكز البئر.
لتصفية DAPI، تعيين LED إلى 10، وقت التكامل إلى 99، واكسب إلى الصفر. لتكساس حمراء, تعيين LED إلى ثمانية, وقت التكامل إلى 950, وكسب إلى 18. انقر فوق خيارات للتأكد من أن يتم تنفيذ التركيز التلقائي على قناة DAPI ولا يوجد أي إزاحة في التركيز بين القنوات.
حفظ البروتوكول بالنقر فوق "حسناً". الآن يمكن تسجيل الصور باستخدام زر قراءة جديدة. مرة واحدة يتم تسجيل الصور، انقر على تقليل البيانات واختيار معالجة الصورة المسبقة.
تطبيق معالجة تمهيدية للصورة باستخدام طرح الخلفية الداكنة باستخدام حجم التسوية التلقائية استنادًا إلى إشارة DAPI. بالنسبة لـ تكساس ريد، استخدم نفس الخيارات الخاصة بالقناة 1. عند الانتهاء، انقر فوق "موافق".
ثم انتقل إلى لوحة تحليل الخلوية وتطبيق قناع نووي على أساس إشارة DAPI المحولة مع قيمة عتبة 6000 وحدة، والحد الأدنى لحجم الكائن من خمسة ميكرومتر وأقصى حجم الكائن من 25 ميكرومتر. تحليل الصورة بأكملها، واستبعاد الكائنات حافة الأساسية على حد الصورة وتقسيم لمس الكائنات. في خيارات الكشف المتقدمة، تعيين قطر الكرة المتداول كما 30 ميكرومتر، وتقييم الخلفية على أساس 5٪ من أدنى بكسل.
احتفظ بعدد الخلايا فقط في المقاييس المحسوبة. بعد ذلك، قم بإجراء تحليل للسكان الفرعيين استنادًا إلى إشارة تكساس الحمراء المحولة مع قيمة عتبة 5000 وحدة لحساب الخلايا الميتة. وأخيراً، الوصول إلى عدد الخلايا الناتجة.
صور تمثيلية للخلايا الملطخة بهيشست، يتم عرض يوديد بروبديسيوم هنا. العدد الإجمالي للخلايا مرتفع بشكل معقول وأكبر من عدد الخلايا الميتة. عندما تمت مقارنة لوحة من مقايسات السمية الخلوية مع الاستبعاد الأزرق trypan، وجد أن MTT والمقايس الزرقاء ألامار قياس غير دقيق الجدوى الخلوية.
وأظهرت هذه المقايسات القائمة على انزيم الميتوكوندريا أقل بكثير من الجدوى مقارنة باستبعاد تريبان الأزرق. كان التلطين المزدوج مع Hoechst 33342 و PI أفضل مزيج من المتانة والحساسية والاتساق مع التلطيخ الأزرق trypan وأصغر انحراف متوسط من طريقة الاستبعاد الأزرق trypan بعد CCP أو 2-DG العلاج. وكان مقال هويشت PI فعالة أيضا في تحديد الجدوى الخلوية بعد العلاج مع جزيئات استهداف الميتوكوندريا Rotenone وثلاثة bromopyruvate.
هو كان أبعد يصادق مع لوحة من سرطان الدم خلية خطوط. هذه الخلايا تختلف في حساسية الرونتينون تتراوح بين حساسة جدا لخلايا المقاومة. قد الأداء غير السليم للمقدّم للخطر دقته.
وتظهر هنا عدة نتائج مخترقة. الإفراط في الاحتواء مع PI ، إهمال خطوة الطرد المركزي ، أو التعرض المفرط في قناة Hoechst ، سيؤدي إلى نتائج دون المستوى الأمثل. في حين توقيت هذا البروتوكول، تذكر لتحسين تركيز الصبغة وتلطيخ الوقت لكل خط الخلية.
أيضا، centrification لطبقة عينة، ضروري لضمان جودة التصوير. بعد تحديد مركبات تأثير السمية الخلوية على الخلايا السرطانية، قد يشرع الباحثون في إجراء دراسات ميكانيكية لتحديد أهدافهم ذات الصلة. فحص مكتبات الجزيئات الصغيرة مع هذه التقنية بالتوازي مع المقايسات MTT التقليدية، وسوف تسمح الجزيئات التي تستهدف وظيفة الميتوكوندريا ليتم تحديدها بسرعة.
