Este trabajo fue apoyado por la Escuela de Ingeniería Pratt de la Universidad de Duke, la División de Nefrología de la Escuela de Medicina de Duke, el Premio de Investigación de una Cátedra del Departamento de Medicina de la Universidad de Duke y un Premio Ad Hoc de Transición de Carrera PDEP del Fondo Burroughs Wellcome a S.M. M.B fue apoyado por el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias. Agradecemos al Laboratorio Bursac por proporcionarnos generosamente la línea de células madre DU11, y al Laboratorio Varghese de la Universidad de Duke por compartir temporalmente sus instalaciones de cultivo de tejidos con nuestro grupo. Esta publicación está dedicada a la Prof. Laura L. Kiessling, Profesora de Química de Novartis en el Instituto de Tecnología de Massachusetts, en celebración de su 60cumpleaños.

1. Preparación de reactivos
<ol><li>Suplemento diluido de medios de cultivo celular hiPS (CCM) descongelado en medio basal de cultivo celular hiPS para obtener una solución 1x de hiPS CCM. NOTA: El suplemento congelado 5x hiPS CCM requiere un proceso de descongelación lento, idealmente en 4 ° C durante la noche. Las alícuotas del 1x hiPS CCM se pueden almacenar hasta 6 meses a -20 °C.</li>
	<li>Preparación de placas recubiertas de matriz de membrana basal (BM) 1 para cultivo celular hiPS: Descongelar la matriz BM 1 durante la noche sobre hielo a 4 °C. Una vez descongeladas, prepare las alícuotas con los factores de dilución apropiados según lo sugerido por el fabricante. NOTA: Por lo general, las alícuotas se preparan para su posterior dilución en 25 ml de DMEM / F12 frío en un tubo cónico de 50 ml seguido de una mezcla completa para disolver completamente la matriz BM 1 y evitar la formación de cristales residuales.</li>
	<li>Transfiera 1 ml de la solución de matriz BM 1 a cada pozo de una placa de 6 pozos e incube a 37 °C durante 1-2 h o a 4 °C durante un mínimo de 24 h, envuelto en película de parafina. Las placas recubiertas de matriz BM 1 se pueden almacenar a 4 °C durante un tiempo de hasta 2 semanas.</li>
	<li>Preparación de la matriz 2 de la membrana basal (BM) - placas recubiertas: Diluya las cantidades apropiadas de la matriz BM 2 en agua destilada estéril de 9 ml para preparar una concentración final de 5 μg / ml. Añadir 700 μL de la solución de matriz BM 2 a cada pozo de una placa de 12 pozos e incubar la placa a temperatura ambiente durante 2 h o durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Preparar soluciones de 100 μg/ml de BSA cada una de BMP7, Activina A y VEGF de la siguiente manera: reconstituir BMP7 en agua destilada estéril que contenga 0,1% (wt/vol) de BSA y reconstituir Activina A y VEGF por separado en PBS estériles que contengan 0,1% (wt/vol) de BSA. Para evitar ciclos frecuentes de congelación-descongelación, prepare alícuotas de 100 μL de cada solución de stock y guárdelo a -20 °C durante un plazo de hasta 6 meses.</li>
	<li>Preparar una solución de 10 mM de Y27632 disolviendo 10 mg de Y27632 en 3.079 mL de agua destilada estéril. Alícuota 100 μL del stock y conservar a -20 °C durante un plazo de hasta 6 meses.</li>
	<li>Disolver 2 mg de CHIR99021 en 143,4 μL de DMSO estéril para preparar una solución de 30 mM. Preparar alícuotas de 5 μL y conservar a -20 °C durante un plazo de hasta 1 mes (o según la recomendación del fabricante).</li>
	<li>Disolver 10 mg de ácidotodo-trans retinoico en 3,33 ml de DMSO estéril. Preparar alícuotas de 500 μL y conservar a -20 °C durante un plazo de hasta 6 meses.</li>
</ol>2. Preparación de medios culturales
<ol><li>Preparar el medio de diferenciación del mesodermo reconstituyendo las soluciones madre correspondientes a una concentración final de 100 ng/mL de Activina A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 y 1x suplemento libre de suero B27 en un volumen apropiado de DMEM/12 con suplemento de glutamina. NOTA: El medio de diferenciación del mesodermo debe estar recién preparado antes de los pasos de diferenciación y a un volumen apropiado para la escala del experimento (típicamente, 50 ml de medio es adecuado para dos placas de 12 pozos).</li>
	<li>Preparar el medio intermedio de diferenciación del mesodermo reconstituyendo las soluciones madre correspondientes a una concentración final de 100 ng/mL BMP7, 3 μM CHIR99021 y 1x suplemento libre de suero B27 en DMEM/F12 con un suplemento de glutamina. NOTA: Si es necesario, el medio se puede complementar con 1% (vol/vol) de penicilina-estreptomicina. Ajuste el volumen del medio usando DMEM / F12 con suplemento de glutamina. Este medio se puede preparar en grandes lotes; sin embargo, se recomienda almacenar en alícuotas más pequeñas (por ejemplo, 45 ml en tubos cónicos de 50 ml) para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación. Este medio se puede almacenar a -20 °C durante un plazo de hasta 3 meses y se puede descongelar a 4 °C durante la noche antes de su uso.</li>
	<li>Preparar el medio de inducción de poocitos reconstituyendo a una concentración final 100 ng/mL BMP7, 100 ng/mL de activina A, 50 ng/mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x suplemento libre de suero B27 y 0,1 μM de ácido todo-trans retinoico en DMEM/F12 con suplemento de glutamina. Proteja el medio de la luz (por ejemplo, envolviendo el recipiente con papel de aluminio). NOTA: Este medio se puede preparar en grandes lotes y almacenar en la oscuridad a -20 °C durante un plazo de hasta 3 meses. Las alícuotas congeladas deben descongelarse durante la noche a 4 °C antes de su uso.</li>
	<li>Preparar 25 ml de solución neutralizante de tripsina añadiendo fbs inactivado por calor al 10% (vol/vol) en DMEM/F12 y filtrar en condiciones estériles.</li>
	<li>Para el mantenimiento posterior a la diferenciación de los podocitos derivados de células madre, prepare complete Medium con medios de mantenimiento de podocitos agregando el suplemento al medio basal según las pautas del fabricante y guárdelo a 4 ° C durante un total de dos semanas.</li>
</ol>3. Cultivo celular hiPS sin alimentador utilizando medio de cultivo celular hiPS
<ol><li>Aspire la solución residual de la matriz BM 1 de las placas pre-recubiertas y lave los pozos 3 veces con 1 a 2 ml de DMEM/F12 calentado.</li>
	<li>Aspire el CCM hiPS gastado de las células hiPS y enjuague las células 3 veces con DMEM / F12 calentado. Agregue 1 ml de solución de desprendimiento de células calientes e incube durante 1 min a 37 ° C para ayudar a disociar las células. Realice una inspección visual de las células bajo un microscopio de cultivo de tejidos y asegúrese de que los bordes de las colonias celulares parezcan redondeados, luego aspire rápidamente la solución de desprendimiento celular de las células (asegurando que las colonias celulares todavía estén unidas a la placa, aunque sea libremente). Enjuague suavemente las células una vez con DMEM/F12 para eliminar la solución de desprendimiento celular.</li>
	<li>Agregue 3 ml de hiPS CCM a las células hiPS (en cada podo de una placa de 6 pomos) que se trataron con la solución de desprendimiento celular. Raspe las colonias usando un elevador de células y pipete suavemente la suspensión de celdas hacia arriba y hacia abajo para desalojar las celdas adheridas. Lave bien el plato para asegurarse de que todas las células se cosechan. NOTA: Se recomienda el uso de una pipeta de 5 ml para evitar el exceso de cizalla en las células.</li>
	<li>Transfiera 0,5 ml de la suspensión celular a cada pozo de una nueva placa de 6 pomos recubierta de matriz BM de 1 que contiene 2 ml de HIPS CCM por pozo. Mueva la placa de la figura ocho para distribuir colonias celulares dentro de los pozos e incube a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 %. Refrescar el medio diariamente hasta que las células estén listas para ser pasadas o utilizadas para el experimento de diferenciación (aproximadamente 70 % de confluencia). NOTA: El tamaño ideal de la colonia para el paso rutinario de iPSCs es de entre 200-500 μm en condiciones libres de alimentador utilizando hiPS CCM (sin inhibidor de ROCK). Si las células se individualizan durante el tratamiento con enzimas de disociación o tampones, el HIPS CCM se puede complementar con un inhibidor de ROCK (por ejemplo, 10 μM Y27632) para mejorar la viabilidad celular.</li>
</ol>4. Diferenciación de células hiPS en células mesodérmicas (días 0-2)
<ol><li>Mientras que los cultivos celulares hiPS se encuentran en la fase de crecimiento exponencial (aproximadamente dentro de los 4 días posteriores al cultivo después del paso, y alrededor del 70% de confluencia), inspeccione visualmente la presencia de células diferenciadas espontáneamente dentro y alrededor de los bordes de las colonias. Si es necesario, raspe asépticamente las áreas de diferenciación.</li>
	<li>Aspire hiPS CCM de células hiPS y enjuague las células 3 veces con DMEM / F12 caliente. Incubar las células con 1 ml de tampón de disociación celular libre de enzimas durante 10 min a 37 °C y comprobar la disociación bajo un microscopio. Debido a las diferencias inherentes entre las diferentes líneas celulares hiPS, el tiempo de incubación real para el tampón de disociación celular debe determinarse para una línea celular determinada.</li>
	<li>Raspe suavemente el pozo con un elevador de células para desalojar las células adheridas y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml, seguido de pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para individualizar las células hiPS.<ol>
<li>Lleve la suspensión celular al volumen de 15 ml con DMEM/F12 caliente y centrífuga durante 5 min a 290 x g a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspire suavemente el sobrenadante y resuspónda las células con DMEM / F12 caliente para otra ronda de centrifugación para eliminar los componentes residuales de la matriz BM 1 y el tampón de disociación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirar las células sobrenadantes y resuspend en 1 ml de medio de inducción del mesodermo como se describe anteriormente. Contar el número total de células utilizando un hemocitómetro o un contador de coulter para determinar el volumen apropiado del medio de diferenciación del mesodermo necesario para lograr una concentración de 1 x 105 células/ml.</li>
	<li>Aspire la solución de ECM de las placas recubiertas de 2 matrices BM y enjuague las placas dos veces con DMEM / F12 caliente. Mezcle la suspensión de la celda hiPS suavemente pipeteando varias veces. Transfiera 1 ml de la suspensión celular a cada pozo de las placas de 12 pozos recubiertas de 2 matriz BM y luego agite suavemente las placas para distribuir las células de manera más uniforme.</li>
	<li>Incubar la placa a 37 °C en una incubadora de 5% de CO2. Refresque el medio de inducción del mesodermo al día siguiente. NOTA: Después de 2 días, las células mesodérmicas derivadas de células hiPS estarían listas para la inducción intermedia del mesodermo.</li>
</ol>5. Diferenciación de células mesodérmicas derivadas de células hiPS en mesodermo intermedio (días 2-16)
<ol><li>En el día 2 del protocolo de diferenciación, aspirar el medio de inducción del mesodermo y reponer con 1 mL por medio de inducción del mesodermo intermedio del pozo.</li>
	<li>Refrescar el medio todos los días para mantener un umbral preciso de factores de crecimiento y moléculas pequeñas para las células metabólicamente activas. Si hay un crecimiento celular sustancial y un rápido agotamiento de los nutrientes de los medios (indicado por el amarilleo de los medios), el volumen del medio de diferenciación del mesodermo intermedio se puede aumentar a 1,3 ml por podo de las placas de 12 pomos.</li>
	<li>Células de cultivo durante 14 días adicionales para obtener células mesodérmicas intermedias. Para el día 16, estas células se pueden criopreservarse para su uso posterior.</li>
</ol>6. Diferenciación de células mesodérmicas intermedias derivadas de células hiPS en podocitos (días 16 a 21)
<ol><li>Enjuague las células mesodérmicas intermedias con DMEM/F12 caliente seguido de incubación de las células con 0,5 ml por podo de tripsina-EDTA al 0,05 % durante 3 min a 37 °C. Realice una inspección visual para asegurarse de que las células están comenzando a disociarse.</li>
	<li>Raspar las células usando un elevador celular y pipetear la suspensión celular varias veces usando una punta de pipeta de 1,000 μL para obtener células individualizadas (o pequeños grupos de). NOTA: En esta etapa, asegúrese de que las células estén completamente disociadas, ya que las células agregadas pueden no adquirir un fenotipo diferenciado terminalmente dentro de la línea de tiempo del protocolo.</li>
	<li>Agregue aproximadamente 2 ml por pozo de solución neutralizante de tripsina para detener la actividad de la tripsina.</li>
	<li>Transfiera las células a un tubo cónico de 50 ml y lleve el volumen hasta 50 ml utilizando DMEM / F12, y luego centrífuga la suspensión de la celda durante 5 minutos a 201 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirar las células sobrenadantes y resuspend en el medio de inducción de poocitos. Para obtener resultados óptimos, asegure una densidad de siembra final de aproximadamente 100,000 células / pozo de una placa de 12 pozos. Agregue la suspensión celular a las placas recubiertas de 2 matrices BM y agite suavemente la placa para ayudar a distribuir las células de manera más uniforme.</li>
	<li>Incubar las células a 37 °C y 5% de CO2 y refrescar el medio diariamente durante un total de 5 días para obtener podocitos para el día 21. NOTA: Los podocitos derivados de células hiPS resultantes se pueden mantener en cultivo durante 2-4 semanas adicionales mediante el uso de medio completo con medios de mantenimiento de podocitos. Una vez en los medios de mantenimiento de podocitos, las células se pueden alimentar cada dos días y se pueden utilizar para estudios posteriores o análisis posteriores.</li>
</ol>

<ol>
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S.M. es autor de una patente pendiente para métodos para la generación de podocitos renales a partir de células madre pluripotentes (solicitud de patente estadounidense 14/950859). Los autores restantes declaran que no tienen intereses contrapuestos.

En este informe, describimos un protocolo para la generación de podocitos glomerulares renales a partir de células hiPS. Los podocitos derivados de células hiPS exhiben características morfológicas y moleculares asociadas con el fenotipo13de podocitos renales maduros. En publicaciones anteriores, demostramos que los podocitos derivados de células hiPS pueden imitar la estructura y la función de filtración selectiva del glomérulo renal cuando se cocultivan con células endoteliales microva...

Los avances en el cultivo de células madre pluripotentes humanas están a punto de revolucionar la medicina regenerativa, el modelado de enfermedades y la detección de fármacos al proporcionar a los investigadores una fuente renovable y escalable de material biológico que puede diseñarse para obtener casi cualquier tipo de célula dentro del cuerpo humano1. Esta estrategia es especialmente útil para derivar tipos de células especializadas y funcionales que de otro modo serían difíciles de obtener. Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPS)2,3,4,5 son particularmente atractivas debido a su origen celular somático y al potencial que representan para la medicina personalizada. Sin embargo, el desarrollo de métodos para derivar otros linajes celulares a partir de células hiPS sigue siendo un desafío debido al uso frecuente de condiciones de cultivo mal definidas que conducen a una baja eficiencia y a la generación inespecífico de poblaciones de células heterogéneas6,7.
Aquí se presenta un método para la derivación de podocitos renales maduros a partir de células hiPS con especificidad y alta eficiencia en condiciones químicamente definidas. Al considerar los roles de múltiples factores dentro del microambiente celular, se desarrolló una estrategia de diferenciación de células madre que implicó la optimización de factores solubles presentados en el medio de cultivo celular, así como factores insolubles, como componentes de matriz extracelular o sustratos adhesivos. Dada la importancia de la señalización de la integrina en el desarrollo y la función de los podocitos, se examinó inicialmente la expresión de los receptores de integrina en la superficie celular. Las integrinas β1 se expresaron altamente no solo en las células hiPS, sino también en sus derivados, incluidas las células mesodermo y mesodermointermedias 8,9,10. Experimentos posteriores confirmaron que los ligandos que se unen a las integrinas β1 (incluyendo laminina 511 o el fragmento de laminina 511-E8) apoyan la adhesión y diferenciación de las células hiPS en podocitos cuando se usan junto con los medios inductivos solubles que se describen a continuación.
La inducción del compromiso de linaje celular se inició confirmando primero que las células hiPS cultivadas en las superficies recubiertas de laminina durante dos días en presencia de un medio que contiene Activina A, CHIR99021 e Y27632 El inhibidor de roca puede diferenciarse en células que expresan los marcadores tempranos del mesodermo HAND1, goosecoid y brachyury8,11. El tratamiento de las células mesodérmicas durante 14 días con un medio suplementado con proteína morfogenética ósea 7 (BMP-7) y CHIR99021 permitió la derivación de células mesodérmicas intermedias que expresaban los marcadores de células progenitoras de nefrona Tumor de Wilm 1 (WT1), proteína relacionada extrañamente omitida 1 (OSR1)8,11y proteína pareada del gen 2 de la caja (PAX2)12. Para derivar los podocitos glomerulares renales maduros, las células mesodérmicas intermedias se trataron durante 4-5 días con un nuevo medio que consiste en BMP-7, activina A, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), ácido retinoicoall-trans y CHIR99021. Se utilizó la citometría de flujo y la inmunotinción para confirmar que >90% de las células resultantes exhibían las características moleculares, morfológicas y funcionales del podocito renal maduro8,11,13. Estas características incluyen el desarrollo de procesos primarios y secundarios del pie; la expresión de genes específicos del linaje de podocitos, incluidos SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 y la expresión de proteínas como podocina, nefrina y WT114,15,16. Además, se encontró que los podocitos derivados de células hiPS se pueden mantener en cultivo durante un máximo de cuatro semanas in vitromedianteel uso de un medio disponible comercialmente 8,11 que proporciona una flexibilidad adicional en el momento de los experimentos posteriores. Para obtener más información sobre los paneles de citometría de flujo utilizados para determinar la pureza de los hiPS-podocitos, consulte nuestra publicación anterior11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DU11 human iPS cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factors and Media Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid (500 mg)</td>
			<td>72262</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 serum-free supplement</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>May show lot-to-lot variation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Medium Kit with CultureBoost-R</td>
			<td>4Z0-500-R</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>Podocyte maintenance media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with GlutaMAX supplement</td>
			<td>10565042</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>DMEM/F12 with glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated FBS</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human activin A</td>
			<td>PHC9564</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BMP7</td>
			<td>PHC9544</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF</td>
			<td>PHC9394</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>05850</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>hiPS cell culture media (CCM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin, liquid (100&#215;)</td>
			<td>15140-163</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 ROCK inhibitor</td>
			<td>1254</td>
			<td>Tocris</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211; and Alexa Fluor 594&#8211;conjugated secondary antibodies</td>
			<td>A32744; A32754; A-11076; A32790</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brachyury(T&#65289;</td>
			<td>ab20680</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nephrin</td>
			<td>GP-N2</td>
			<td>Progen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4</td>
			<td>AF1759</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX2</td>
			<td>71-6000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT1</td>
			<td>MAB4234</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM Molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment</td>
			<td>N-892012</td>
			<td>Iwai North America</td>
			<td>Basement membrane (BM) matrix 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial</td>
			<td>354277</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes and Other Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>A9418</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>D2438</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank&#8217;s balanced salt</td>
			<td>13150016</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade</td>
			<td>97065-058</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Ethanol is flammable and toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>431097</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>28906</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Distilled Water</td>
			<td>15230162</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>97062-208</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td>
			<td>25300-120</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating pipettes, individually wrapped</td>
			<td>29442-462</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-15R Centrifuge</td>
			<td>B99516</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>352097</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>352098</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoboxes</td>
			<td>3395465</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>For storing frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M7000</td>
			<td>AMF7000</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>100503-092</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>51030403</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera</td>
			<td>491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark nitrile gloves</td>
			<td>40101-346</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, large</td>
			<td>21905-049</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, small</td>
			<td>21905-026</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 precision barrier pipette tips</td>
			<td>P1096-FR</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 barrier pipette tips</td>
			<td>P1125</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 barrier pipette tips</td>
			<td>P1126</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 barrier pipette tips</td>
			<td>P1121</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 barrier pipette tips</td>
			<td>P1122</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 10 mL, individually wrapped</td>
			<td>356551</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 25 mL, individually wrapped</td>
			<td>356525</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 5 mL, individually wrapped</td>
			<td>356543</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip, 0.22 &#956;m, PES</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>1138W14</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>For aliquoting growth factors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 12-well plates</td>
			<td>353043</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated six-well plates</td>
			<td>353046</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR white techuni lab coat</td>
			<td>10141-342</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-beveled cell lifter</td>
			<td>3008</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions

La enfermedad renal afecta a más del 10% de la población mundial y cuesta miles de millones de dólares en gastos federales. Las formas más graves de enfermedad renal y eventual insuficiencia renal en etapa terminal a menudo son causadas por el daño a los podocitos glomerulares, que son las células epiteliales altamente especializadas que funcionan junto con las células endoteliales y la membrana basal glomerular para formar la barrera de filtración del riñón. Los avances en medicina renal se han visto obstaculizados por la limitada disponibilidad de tejidos primarios y la falta de métodos robustos para la derivación de células renales humanas funcionales, como los podocitos. La capacidad de derivar podocitos de fuentes renovables, como las células madre, podría ayudar a avanzar en la comprensión actual de los mecanismos del desarrollo y la enfermedad renal humana, así como proporcionar nuevas herramientas para el descubrimiento terapéutico. El objetivo de este protocolo era desarrollar un método para derivar podocitos maduros postmitóticos a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPS) con alta eficiencia y especificidad, y en condiciones químicamente definidas. Los podocitos derivados de células hiPS producidos por este método expresan marcadores específicos del linaje (incluyendo nefrina, podocina y tumor de Wilm 1) y exhiben las características morfológicas especializadas (incluidos los procesos primarios y secundarios del pie) asociadas con podocitos maduros y funcionales. Curiosamente, estas características especializadas están notablemente ausentes en la línea celular de podocitos inmortalizados ampliamente utilizada en el campo, lo que sugiere que el protocolo descrito aquí produce podocitos renales humanos que tienen un fenotipo de desarrollo más maduro que las líneas celulares de podocitos existentes típicamente utilizadas para estudiar la biología del riñón humano.

El objetivo de este protocolo era demostrar que los podocitos humanos maduros pueden derivarse de células hiPS en condiciones químicamente definidas. Los datos presentados en este manuscrito se generaron mediante el uso de la línea celular DU11 hiPS17,que se probó por primera vez y se encontró que estaba libre de micoplasma. También se realizó un análisis cromosómico, y se encontró que las células eran cariotípicamente normales. Comenzando con las células hiPS DU11 indiferenciadas, la...

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Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Aquí se presenta un protocolo definido químicamente para la derivación de podocitos renales humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas con alta eficiencia (>90%) e independiente de manipulaciones genéticas o selección de subpoblaciones. Este protocolo produce el tipo de célula deseado dentro de los 26 días y podría ser útil para las pruebas de nefrotoxicidad y el modelado de enfermedades.

Diferenciación guiada de podocitos renales maduros de células madre pluripotentes inducidas por humanos en condiciones químicamente definidas

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

guided-differentiation-mature-kidney-podocytes-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.4K vistas.  Duke University. Aquí se presenta un protocolo definido químicamente para la derivación de podocitos renales humanos a partir de células madre pluripotentes inducidas con alta eficiencia (>90%) e independiente de manipulaciones genéticas o selección de subpoblaciones. Este protocolo produce el tipo de célula deseado dentro de los 26 días y podría ser útil para las pruebas de nefrotoxicidad y el modelado de enfermedades.

Video: Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Desarrollo, la expansión y<em&gt; En vivo</em&gt; Monitoreo de las células NK humanas a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs) y y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Investigación

Bioingeniería

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

Aislamiento de células madre mesenquimatosas del periostio Alveolar humano y efectos de la vitamina D en la actividad osteogénica de células derivadas del periostio

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

Cultura de células madre humanas pluripotentes en polivinilos hidrogeles ácidos itacónico-Co-Alcohol con rigidez variable en condiciones libres de Xeno

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable diseases, for the reconstitution and regeneration of injured tissues and for the development of new drugs. Despite all the advantages related to the use of iPSCs, such as the low risk of rejection, the lessened ethical issues, and the possibility to obtain them from both young and old patients without any difference in their reprogramming potential, problems to overcome are still numerous. In fact, cell reprogramming conducted with viral and integrating viruses can cause infections and the introduction of required genes can induce a genomic instability of the recipient cell, impairing their use in clinic. In particular, there are many concerns about the use of c-Myc gene, well-known from several studies for its mutation-inducing activity. Fibroblasts have emerged as the suitable cell population for cellular reprogramming as they are easy to isolate and culture and are harvested by a minimally invasive skin punch biopsy. The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the whole procedure, from sample processing to obtain cell cultures, choice of reagents and supplies, cleaning and preparation, to cell reprogramming by the means of a commercial non-modified RNAs (NM-RNAs)-based reprogramming kit. The chosen reprogramming kit allows an effective reprogramming of human dermal fibroblast to iPSCs and small colonies can be seen as early as 24 h after the first transfection, even with modifications with the respect to the standard datasheet. The reprogramming procedure used in this protocol offers the advantage of a safe reprogramming, without the risk of infections caused by viral vector-based methods, reduces the cellular defense mechanisms, and allows the generation of xeno-free iPSCs, all critical features that are mandatory for further clinical applications.

Cell reprogramming requires the introduction of key genes, which regulate and maintain the pluripotent cell state. The protocol described enables the formation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) colonies from human dermal fibroblasts without viral/integrating methods but using non-modified RNAs (NM-RNAs) combined with immune evasion factors reducing cellular defense mechanisms.

Aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos adultos de la piel abdominal y generación de células madre pluripotentes inducidas utilizando un método no integrador

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can trigger cerebellar dysfunction. Most of the current knowledge about disease-related neuronal phenotypes is based on postmortem tissues, which makes understanding of disease progression and development difficult. Animal models and immortalized cell lines have also been used as models for neurodegenerative disorders. However, they do not fully recapitulate human disease. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have great potential for disease modeling and provide a valuable source for regenerative approaches. In recent years, the generation of cerebral organoids from patient-derived iPSCs improved the prospects for neurodegenerative disease modeling. However, protocols that produce large numbers of organoids and a high yield of mature neurons in 3D culture systems are lacking. The protocol presented is a new approach for reproducible and scalable generation of human iPSC-derived organoids under chemically-defined conditions using scalable single-use bioreactors, in which organoids acquire cerebellar identity. The generated organoids are characterized by the expression of specific markers at both mRNA and protein level. The analysis of specific groups of proteins allows the detection of different cerebellar cell populations, whose localization is important for the evaluation of organoid structure. Organoid cryosectioning and further immunostaining of organoid slices are used to evaluate the presence of specific cerebellar cell populations and their spatial organization.

This protocol describes a dynamic culture system to produce controlled size aggregates of human pluripotent stem cells and further stimulate differentiation in cerebellar organoids under chemically-defined and feeder-free conditions using a single-use bioreactor.

Generación escalable de organoides cerebelosos maduros a partir de células madre pluripotentes humanas y caracterización por inmunosuización

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

Tejido conectivo de ingeniería humana derivado de fibroblastos para aplicaciones de detección

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of functional models that can accurately predict human biological responses and nephrotoxicity. Advancements in kidney precision medicine could help overcome these limitations. However, previously established in vitro models of the human kidney glomerulus-the primary site for blood filtration and a key target of many diseases and drug toxicities-typically employ heterogeneous cell populations with limited functional characteristics and unmatched genetic backgrounds. These characteristics significantly limit their application for patient-specific disease modeling and therapeutic discovery. 
This paper presents a protocol that integrates human induced pluripotent stem (iPS) cell-derived glomerular epithelium (podocytes) and vascular endothelium from a single patient to engineer an isogenic and vascularized microfluidic kidney glomerulus chip. The resulting glomerulus chip is comprised of stem cell-derived endothelial and epithelial cell layers that express lineage-specific markers, produce basement membrane proteins, and form a tissue-tissue interface resembling the kidney's glomerular filtration barrier. The engineered glomerulus chip selectively filters molecules and recapitulates drug-induced kidney injury. The ability to reconstitute the structure and function of the kidney glomerulus using isogenic cell types creates the opportunity to model kidney disease with patient specificity and advance the utility of organs-on-chips for kidney precision medicine and related applications.

Presented here is a protocol to engineer a personalized organ-on-a-chip system that recapitulates the structure and function of the kidney glomerular filtration barrier by integrating genetically matched epithelial and vascular endothelial cells differentiated from human induced pluripotent stem cells. This bioengineered system can advance kidney precision medicine and related applications.

Chip de glomérulo renal isogénico diseñado a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study defined aspects of that organ in a tissue culture dish. The breadth and application of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived organoid research have advanced significantly to include the brain, retina, tear duct, heart, lung, intestine, pancreas, kidney, and blood vessels, among several other tissues. The development of methods for the generation of human microvessels, specifically, has opened the way for modeling human blood vessel development and disease in vitro and for the testing and analysis of new drugs or tissue tropism in virus infections, including SARS-CoV-2. Complex and lengthy protocols lacking visual guidance hamper the reproducibility of many stem cell-derived organoids. Additionally, the inherent stochasticity of organoid formation processes and self-organization necessitates the generation of optical protocols to advance the understanding of cell fate acquisition and programming. Here, a visually guided protocol is presented for the generation of 3D human blood vessel organoids (BVOs) engineered from hPSCs. Presenting a continuous basement membrane, vascular endothelial cells, and organized articulation with mural cells, BVOs exhibit the functional, morphological, and molecular features of human microvasculature. BVO formation is initiated through aggregate formation, followed by mesoderm and vascular induction. Vascular maturation and network formation are initiated and supported by embedding aggregates in a 3D collagen and solubilized basement membrane matrix. Human vessel networks form within 2-3 weeks and can be further grown in scalable culture systems. Importantly, BVOs transplanted into immunocompromised mice anastomose with the endogenous mouse circulation and specify into functional arteries, veins, and arterioles. The present visually guided protocol will advance human organoid research, particularly in relation to blood vessels in normal development, tissue vascularization, and disease.

This protocol describes the generation of self-organizing blood vessels from human pluripotent and induced pluripotent stem cells. These blood vessel networks exhibit an extensive and connected endothelial network surrounded by pericytes, smooth muscle actin, and a continuous basement membrane.

Generación de organoides de vasos sanguíneos humanos a partir de células madre pluripotentes

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...