Diese Arbeit wurde von der Pratt School of Engineering an der Duke University, der Division of Nephrology an der Duke Medical School, dem A Chair's Research Award des Department of Medicine der Duke University und einem Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award an S.M unterstützt. M.B wurde durch das Graduate Research Fellowship Program der National Science Foundation unterstützt. Wir danken dem Bursac Lab für die großzügige Bereitstellung der DU11-Stammzelllinie und dem Varghese Lab an der Duke University für die vorübergehende Freigabe ihrer Gewebekultureinrichtung mit unserer Gruppe. Diese Publikation ist Prof. Laura L. Kiessling, Novartis Professorin für Chemie am Massachusetts Institute of Technology, anlässlich ihres 60.Geburtstages gewidmet.

1. Herstellung von Reagenzien
<ol><li>Verdünnen Sie aufgetaute 5x hiPS Zellkulturmedien (CCM) Ergänzung in hiPS Zellkultur Basalmedium, um eine 1x Lösung von hiPS CCM zu erhalten. HINWEIS: Gefrorene 5x hiPS CCM Ergänzung erfordert einen langsamen Auftauprozess, idealerweise bei 4 ° C für über Nacht. Aliquots des 1x hiPS CCM können bis zu 6 Monate bei -20 °C gelagert werden.</li>
	<li>Herstellung von Basalmembran (BM) Matrix 1-beschichteten Platten für hiPS Zellkultur: BM Matrix 1 über Nacht auf Eis bei 4 °C auftauen. Nach dem Auftauen Aliquoten mit geeigneten Verdünnungsfaktoren vorbereiten, wie vom Hersteller vorgeschlagen. HINWEIS: Typischerweise werden Aliquoten für die anschließende Verdünnung in 25 ml kaltem DMEM/F12 in einem konischen 50-ml-Röhrchen vorbereitet, gefolgt von einer gründlichen Mischung, um die BM-Matrix 1 vollständig aufzulösen und die Bildung von Restkristallen zu vermeiden.</li>
	<li>1 ml der BM-Matrix-1-Lösung in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte geben und bei 37 °C für 1-2 h oder bei 4 °C für mindestens 24 h inkubieren, in Paraffinfolie eingewickelt. Die BM matrix 1 -beschichteten Platten können bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.</li>
	<li>Herstellung der Basalmembran (BM) Matrix 2 - beschichtete Platten: Verdünnen Sie geeignete Mengen bm matrix 2 in 9 mL sterilem destilliertem Wasser, um eine Endkonzentration von 5 μg/ml herzustellen. 700 μL der BM-Matrix-2-Lösung in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte geben und die Platte bei Raumtemperatur für 2 h oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>100 μg/ml Stammlösungen von BMP7, Activin A und VEGF werden wie folgt zubereitet: BMP7 in sterilem destilliertem Wasser mit 0,1 % (Gew./Vol)BSA rekonstituieren und Activin A und VEGF separat in sterilem PBS mit 0,1 % (Gew./Vol) BSA rekonstituieren. Um häufige Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden, bereiten Sie 100 μL Aliquoten aus jeder Lagerlösung vor und lagern Sie sie bei -20 °C für bis zu 6 Monate.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 10 mM Stammlösung von Y27632 vor, indem Sie 10 mg Y27632 in 3,079 ml sterilem destilliertem Wasser auflösen. Aliquot 100 μL aus dem Lager und lagern Sie bei -20 °C für bis zu 6 Monate.</li>
	<li>2 mg CHIR99021 werden in 143,4 μL sterilem DMSO gelöst, um eine 30 mM Stammlösung zu erhalten. 5 μL Aliquoten vorbereiten und bei -20 °C bis zu 1 Monat lagern (oder nach Herstellerempfehlung).</li>
	<li>10 mg Trans-Retinsäure in 3,33 ml sterilem DMSO auflösen. 500 μL Aliquoten vorbereiten und bei -20 °C bis zu 6 Monate lagern.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Kulturmedien
<ol><li>Bereiten Sie das Mesodermdifferenzierungsmedium vor, indem Sie entsprechende Stammlösungen zu einer Endkonzentration von 100 ng/ ml Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 und 1x B27 serumfreie Ergänzung in einem geeigneten Volumen von DMEM/12 mit Glutaminpräparat rekonstituieren. HINWEIS: Das Mesodermdifferenzierungsmedium sollte vor den Differenzierungsschritten und in einem für den Umfang des Experiments geeigneten Volumen frisch zubereitet werden (typischerweise sind 50 ml Medium für zwei 12-Well-Platten ausreichend).</li>
	<li>Herstellung eines Intermesodermdifferenzierungsmediums, indem entsprechende Stammlösungen zu einer Endkonzentration von 100 ng/ml BMP7, 3 μM CHIR99021 und 1x B27 serumfreien Ergänzung in DMEM/F12 mit einem Glutaminpräparat rekonstituiert werden. HINWEIS: Bei Bedarf kann das Medium mit 1% (vol/vol) Penicillin-Streptomycin ergänzt werden. Stellen Sie die Lautstärke des Mediums ein, indem Sie DMEM / F12 mit Glutaminpräparat verwenden. Dieses Medium kann in großen Chargen hergestellt werden; Es wird jedoch empfohlen, in kleineren Aliquoten (z. B. 45 ml in konischen 50 ml Röhrchen) zu lagern, um wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden. Diese Medien können bis zu 3 Monate bei -20 °C gelagert und vor Gebrauch über Nacht bei 4 °C aufgetaut werden.</li>
	<li>Bereiten Sie das Podozyteninduktionsmedium vor, indem Sie es auf eine Endkonzentration von 100 ng / ml BMP7, 100 ng / ml Aktivin A, 50 ng / ml VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 serumfreie Ergänzung und 0,1 μM All-trans-Retinsäure in DMEM / F12 mit Glutaminpräparat rekonstituieren. Medium vor Licht schützen (z.B. durch Einwickeln des Behälters mit Folienpapier). HINWEIS: Dieses Medium kann in großen Chargen zubereitet und im Dunkeln bei -20 °C bis zu 3 Monate gelagert werden. Gefrorene Aliquoten sollten vor Gebrauch über Nacht bei 4 °C aufgetaut werden.</li>
	<li>Bereiten Sie 25 ml Trypsin-Neutralisationslösung vor, indem Sie 10% (vol / vol) wärmeinaktiviertes FBS in DMEM / F12 hinzufügen und unter sterilen Bedingungen filtern.</li>
	<li>Für die Aufrechterhaltung der aus Stammzellen gewonnenen Podozyten nach der Differenzierung bereiten Sie Complete Medium mit Podozyten-Erhaltungsmedien vor, indem Sie das Supplement gemäß den Richtlinien des Herstellers zum Basalmedium hinzufügen und bei 4 °C bis zu zwei Wochen lagern.</li>
</ol>3. Feederfreie hiPS-Zellkultur mit hiPS-Zellkulturmedium
<ol><li>Die Restlösung der BM-Matrix 1 von den vorbeschichteten Platten absaugen und die Vertiefungen 3 mal mit 1 bis 2 ml erwärmtem DMEM/F12 waschen.</li>
	<li>Saugen Sie verbrauchtes hiPS CCM aus den hiPS-Zellen und spülen Sie die Zellen 3 mal mit erwärmtem DMEM / F12. Fügen Sie 1 ml warme Zellablösungslösung hinzu und inkubieren Sie sie für 1 minute bei 37 ° C, um die Zellen zu dissoziieren. Führen Sie eine visuelle Inspektion der Zellen unter einem Gewebekulturmikroskop durch und stellen Sie sicher, dass die Ränder der Zellkolonien abgerundet erscheinen, und saugen Sie dann schnell die Zellablösungslösung von den Zellen ab (um sicherzustellen, dass die Zellkolonien immer noch an der Platte befestigt sind, wenn auch locker). Spülen Sie die Zellen einmal vorsichtig mit DMEM/F12 ab, um die Zellablösungslösung zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 3 ml hiPS CCM zu den hiPS-Zellen (in jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte) hinzu, die mit der Zellablösungslösung behandelt wurden. Kratzen Sie Kolonien mit einem Zelllifter und pipetetten Sie die Zellsuspension vorsichtig nach oben und unten, um die lose anhaftenden Zellen zu lösen. Waschen Sie den Teller gründlich, um sicherzustellen, dass alle Zellen geerntet werden. HINWEIS: Die Verwendung einer 5-ml-Pipette wird empfohlen, um eine übermäßige Scherung der Zellen zu vermeiden.</li>
	<li>0,5 ml der Zellsuspension werden in jede Vertiefung einer neuen BM-Matrix-1-beschichteten 6-Well-Platte mit 2 ml hiPS-CCM pro Vertiefung übertragen. Bewegen Sie die Platte in Figur-Acht-Manier, um Zellkolonien in Vertiefungen zu verteilen und bei 37 °C in einem 5 % CO 2-Inkubatorzu inkubieren. Das Medium täglich auffrischen, bis die Zellen bereit sind, durchzufahren oder für das Differenzierungsexperiment verwendet zu werden (ca. 70 % Konfluenz). HINWEIS: Die ideale Koloniegröße für das routinemäßige Passieren von iPSCs liegt zwischen 200-500 μm unter feederfreien Bedingungen mit hiPS CCM (ohne ROCK-Inhibitor). Werden Zellen während der Behandlung mit Dissoziationsenzymen oder Puffern individualisiert, kann das hiPS CCM mit ROCK-Inhibitor (z.B. 10 μM Y27632) ergänzt werden, um die Zelllebensfähigkeit zu verbessern.</li>
</ol>4. Differenzierung von hiPS-Zellen in Mesodermzellen (Tage 0-2)
<ol><li>Während sich die hiPS-Zellkulturen in der exponentiellen Wachstumsphase befinden (etwa innerhalb von 4 Tagen nach der Kultur nach dem Passaging und etwa 70% Konfluenz), untersuchen Sie visuell auf das Vorhandensein spontan differenzierter Zellen innerhalb und um die Ränder der Kolonien. Bei Bedarf Differenzierungsbereiche aseptisch abkratzen.</li>
	<li>Saugen Sie hiPS CCM aus hiPS-Zellen und spülen Sie die Zellen 3 mal mit warmem DMEM/F12. Inkubieren Sie die Zellen mit 1 ml enzymfreiem Zelldissoziationspuffer für 10 min bei 37 °C und überprüfen Sie die Dissoziation unter einem Mikroskop. Aufgrund inhärenter Unterschiede zwischen verschiedenen hiPS-Zelllinien muss die tatsächliche Inkubationszeit für den Zelldissoziationspuffer für eine bestimmte Zelllinie bestimmt werden.</li>
	<li>Kratzen Sie den Brunnen vorsichtig mit einem Zelllifter ab, um lose anhaftende Zellen zu lösen, und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 mL konisches Rohr, gefolgt von mehrmaligem Pipettieren auf und ab, um die hiPS-Zellen zu individualisieren.<ol>
<li>Zellsuspension mit warmem DMEM/F12 und Zentrifuge für 5 min bei 290 x g bei Raumtemperatur auf das 15 mL Volumen bringen.</li>
		<li>Saugen Sie vorsichtig den Überstand an und reanimieren Sie die Zellen mit warmem DMEM / F12 für eine weitere Runde der Zentrifugation, um restierende BM-Matrix 1- und Dissoziationspufferkomponenten zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Saugen Sie die überstandenden und resuspendierten Zellen in 1 ml Mesoderm-Induktionsmedium ab, wie oben beschrieben. Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einem Hämozytometer oder einem Zähler, um das geeignete Volumen des Mesodermdifferenzierungsmediums zu bestimmen, das erforderlich ist, um eine Konzentration von 1 x 105 Zellen / ml zu erreichen.</li>
	<li>Saugen Sie ECM-Lösung aus den BM matrix 2-beschichteten Platten an und spülen Sie die Platten zweimal mit warmem DMEM/F12 ab. Mischen Sie die hiPS-Zellsuspension vorsichtig durch einige Male pipettieren. 1 ml der Zellsuspension auf jede Vertiefung der BM-Matrix 2-beschichteten 12-Well-Platten geben und dann die Platten vorsichtig schütteln, um die Zellen gleichmäßiger zu verteilen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem 5% CO2 Inkubator. Erfrischen Sie das Mesoderm-Induktionsmedium am nächsten Tag. HINWEIS: Nach 2 Tagen wären hiPS-Zell-abgeleitete Mesodermzellen bereit für die intermediäre Mesoderminduktion.</li>
</ol>5. Differenzierung von hiPS-Zell-abgeleiteten Mesodermzellen in intermediäre Mesodermzellen (Tage 2-16)
<ol><li>Am Tag 2 des Differenzierungsprotokolls mesoderm-Induktionsmedium absaugen und mit 1 ml pro Vertiefung intermediäres Mesoderm-Induktionsmedium auffüllen.</li>
	<li>Aktualisieren Sie das Medium jeden Tag, um eine genaue Schwelle von Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen für die metabolisch aktiven Zellen aufrechtzuerhalten. Bei erheblichem Zellwachstum und rascher Erschöpfung der Mediennährstoffe (angezeigt durch die Gelbfärbung des Mediums) kann das Volumen des zwischengeschalteten Mesodermdifferenzierungsmediums auf 1,3 ml pro Vertiefung der 12 Wellplatten erhöht werden.</li>
	<li>Kulturzellen für weitere 14 Tage, um intermediäre Mesodermzellen zu erhalten. Bis zum 16. Tag können diese Zellen für die spätere Verwendung kryokonserviert werden.</li>
</ol>6. Differenzierung von hiPS-Zell-abgeleiteten zwischenmesodermzellen in Podozyten (Tage 16 bis 21)
<ol><li>Spülen Sie die zwischengeschalteten Mesodermzellen mit warmem DMEM/F12, gefolgt von einer Inkubation der Zellen mit 0,5 ml pro Vertiefung von 0,05 % Trypsin-EDTA für 3 min bei 37 °C. Führen Sie eine visuelle Inspektion durch, um sicherzustellen, dass die Zellen beginnen, sich zu dissoziieren.</li>
	<li>Kratzen Sie Zellen mit einem Zelllifter und pipetieren Sie die Zellsuspension mehrmals mit einer 1.000 μL Pipettenspitze, um individualisierte (oder kleine Klumpen von) Zellen zu erhalten. HINWEIS: Stellen Sie in diesem Stadium sicher, dass die Zellen vollständig dissoziiert sind, da aggregierte Zellen möglicherweise keinen terminal differenzierten Phänotyp innerhalb der Zeitleiste des Protokolls erwerben.</li>
	<li>Fügen Sie etwa 2 ml pro Vertiefung Trypsin neutralisierende Lösung hinzu, um die Aktivität von Trypsin zu stoppen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen in ein konisches 50-ml-Rohr und bringen Sie das Volumen mit DMEM/ F12 auf 50 ml und zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension für 5 min bei 201 x g bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Saugen Sie die überstandenden und resuspendierten Zellen im Podozyteninduktionsmedium ab. Für optimale Ergebnisse stellen Sie eine endgültige Aussaatdichte von etwa 100.000 Zellen / Vertiefung einer 12-Well-Platte sicher. Fügen Sie die Zellsuspension zu den 2-beschichteten BM-Matrix-Platten hinzu und schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen gleichmäßiger zu verteilen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5% CO2 und erfrischen Sie das Medium täglich für bis zu 5 Tage, um bis zum 21. Tag Podozyten zu erhalten. HINWEIS: Die resultierenden hiPS-Zell-abgeleiteten Podozyten können für 2-4 zusätzliche Wochen in Kultur gehalten werden, indem ein vollständiges Medium mit Podozyten-Erhaltungsmedien verwendet wird. Einmal in Podozyten-Erhaltungsmedien, können die Zellen jeden zweiten Tag gefüttert werden und können für nachfolgende Studien oder nachgeschaltete Analysen verwendet werden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Pluripotent+Stem+Cells:+History,+Mechanisms,+Technologies,+and+Applications.">Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).</li><li>Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine:+challenges+and+recent+progress.">Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282, 1145 (1998).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526, 564-568 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).</li><li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+mature+kidney+podocytes+and+establishment+of+a+Glomerulus+Chip.">Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip.</a> Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).</li><li>Pozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta1+integrin+expression+by+podocytes+is+required+to+maintain+glomerular+structural+integrity.">Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity.</a> Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).</li><li>Kanasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+beta1-mediated+matrix+assembly+and+signaling+are+critical+for+the+normal+development+and+function+of+the+kidney+glomerulus.">Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus.</a> Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).</li><li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip.">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).</li><li>Torban, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX2+Activates+WNT4+Expression+during+Mammalian+Kidney+Development.">PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).</li><li>Reiser, J., Sever, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte+biology+and+pathogenesis+of+kidney+disease.">Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease.</a> Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).</li><li>Kuusniemi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Expression+of+Nephrin+in+Human+and+Pig.">Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig.</a> Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).</li><li>Guo, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WT1+is+a+key+regulator+of+podocyte+function:+reduced+expression+levels+cause+crescentic+glomerulonephritis+and+mesangial+sclerosis.">WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).</li><li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocin+localizes+in+the+kidney+to+the+slit+diaphragm+area.">Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area.</a> American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).</li><li>Shadrin, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiopatch+platform+enables+maturation+and+scale-up+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+engineered+heart+tissues.">Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues.</a> Nature Communications. 8, 1825 (2017).</li><li>Satoh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKC&#955;+maintains+the+integrity+of+the+glomerular+slit+diaphragm+through+trafficking+of+nephrin+to+the+cell+surface.">aPKC&#955; maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface.</a> The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).</li><li>Mae, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+robust+induction+of+nephrogenic+intermediate+mesoderm+from+human+pluripotent+stem+cells.">Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 4, 1367 (2013).</li><li>Reya, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+in+stem+cells+and+cancer.">Wnt signalling in stem cells and cancer.</a> Nature. 434, 843-850 (2005).</li><li>Clevers, H., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt&#946;-Catenin+Signaling+and+Disease.">Wnt&#946;-Catenin Signaling and Disease.</a> Cell. 149, 1192-1205 (2012).</li><li>Ciampi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+podocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).</li><li>Fuente Mora, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Podocyte+and+Proximal+Tubule-Like+Cells+from+a+Mouse+Kidney-Derived+Stem+Cell+Line.">Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line.</a> Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).</li><li>Chuah, J. K. C., Zink, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+kidney+cells+and+organoids:+Recent+breakthroughs+and+emerging+applications.">Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications.</a> Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).</li><li>Becker, G. J., Hewitson, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+chronic+kidney+disease:+useful+but+not+perfect.">Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).</li></ol>

S.M. ist Autor eines zum Patent angemeldeten Patents für Verfahren zur Erzeugung von Nierenpodozyten aus pluripotenten Stammzellen (US-Patentanmeldung 14/950859). Die übrigen Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

In diesem Bericht beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von glomerulären Nierenpodozyten aus hiPS-Zellen. Die von hiPS-Zellen abgeleiteten Podozyten weisen morphologische und molekulare Merkmale auf, die mit dem reifen Nierenpodozytenphänotyp13assoziiert sind. In früheren Veröffentlichungen haben wir gezeigt, dass die von hiPS-Zellen abgeleiteten Podozyten die Struktur und selektive Filtrationsfunktion des Nierenglomerulus nachahmen können, wenn sie mit glomerulären mikrovaskulären En...

Fortschritte in der humanen pluripotenten Stammzellkultur sind bereit, die regenerative Medizin, die Krankheitsmodellierung und das Drogenscreening zu revolutionieren, indem sie Forschern eine erneuerbare, skalierbare Quelle für biologisches Material zur Verfügung stellen, die entwickelt werden kann, um fast jeden Zelltyp im menschlichen Körper zu erhalten1. Diese Strategie ist besonders nützlich, um spezialisierte und funktionelle Zelltypen abzuleiten, die sonst schwer zu erhalten wären. Human induced pluripotent stem (hiPS) Zellen2,3,4,5 sind aufgrund ihrer somatischen Zellursprung und des Potenzials, das sie für die personalisierte Medizin darstellen, besonders attraktiv. Die Entwicklung von Methoden zur Ableitung anderer Zelllinien aus hiPS-Zellen bleibt jedoch aufgrund der häufigen Verwendung schlecht definierter Kulturbedingungen, die zu einer geringen Effizienz und unspezifischen Erzeugung heterogener Zellpopulationenführen,eine Herausforderung6,7.
Hier wird eine Methode zur Ableitung reifer Nierenpodozyten aus hiPS-Zellen mit Spezifität und hoher Effizienz unter chemisch definierten Bedingungen vorgestellt. Unter Berücksichtigung der Rolle mehrerer Faktoren innerhalb der zellulären Mikroumgebung wurde eine Stammzelldifferenzierungsstrategie entwickelt, die die Optimierung löslicher Faktoren im Zellkulturmedium sowie unlöslicher Faktoren wie extrazelluläre Matrixkomponenten oder adhäsive Substrate beinhaltete. Angesichts der Bedeutung der Integrinsignalisierung für die Entwicklung und Funktion von Podozyten wurde zunächst die Expression von Integrinrezeptoren auf der Zelloberfläche untersucht. β1-Integrine wurden nicht nur in hiPS-Zellen, sondern auch in ihren Derivaten einschließlich Mesoderm- und Intermesodermzellen stark exprimiert8,9,10. Nachfolgende Experimente bestätigten, dass Liganden, die an β1-Integrine binden (einschließlich Laminin 511 oder Laminin 511-E8-Fragment), die Adhäsion und Differenzierung von hiPS-Zellen in Podozyten unterstützen, wenn sie in Verbindung mit den unten beschriebenen löslichen induktiven Medien verwendet werden.
Die Induktion der Zelllinienverpflichtung wurde eingeleitet, indem zunächst bestätigt wurde, dass hiPS-Zellen, die zwei Tage lang auf den lamininbeschichteten Oberflächen in Gegenwart eines Mediums kultiviert wurden, das Activin A, CHIR99021 und Y27632 Rock-Inhibitor enthält, sich in Zellen differenzieren können, die die frühen Mesodermmarker HAND1, Goosecoid und Brachyury8,11exprimieren. Die Behandlung der Mesodermzellen für 14 Tage mit einem Medium, das mit Knochenmorphogenetikprotein 7 (BMP-7) und CHIR99021 ergänzt wurde, ermöglichte die Ableitung von intermediären Mesodermzellen, die die Nephron-Vorläuferzellmarker Wilms Tumor 1 (WT1), odd-skipped related protein 1 (OSR1)8,11und paired box gene 2 protein (PAX2)12exprimierten. Um die reifen glomerulären Nierenpodozyten abzuleiten, wurden die intermediären Mesodermzellen 4–5 Tage lang mit einem neuartigen Medium behandelt, das aus BMP-7, Activin A, vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor (VEGF),All-trans-Retinsäure und CHIR99021 besteht. Durchflusszytometrie und Immunfärbung wurden verwendet, um zu bestätigen, dass >90% der resultierenden Zellen die molekularen, morphologischen und funktionellen Eigenschaften des reifen Nierenpodozytenaufwiesen 8,11,13. Zu diesen Eigenschaften gehören die Entwicklung von primären und sekundären Fußprozessen; die Expression von Podozytenlinien-spezifischen Genen einschließlich SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 und die Expression von Proteinen wie Podocin, Nephrin und WT114,15,16. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die von hiPS-Zellen abgeleiteten Podozyten bis zu vier Wochen in vitro in Kultur gehalten werdenkönnen,indem ein kommerziell erhältliches Medium8,11 verwendet wird, das eine zusätzliche Flexibilität beim Timing nachgeschalteter Experimente bietet. Weitere Informationen zu den Durchflusszytometrie-Panels, die zur Bestimmung der Reinheit der hiPS-Podozyten verwendet werden, finden Sie in unserer vorherigen Publikation11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DU11 human iPS cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factors and Media Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid (500 mg)</td>
			<td>72262</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 serum-free supplement</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>May show lot-to-lot variation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Medium Kit with CultureBoost-R</td>
			<td>4Z0-500-R</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>Podocyte maintenance media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with GlutaMAX supplement</td>
			<td>10565042</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>DMEM/F12 with glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated FBS</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human activin A</td>
			<td>PHC9564</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BMP7</td>
			<td>PHC9544</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF</td>
			<td>PHC9394</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>05850</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>hiPS cell culture media (CCM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin, liquid (100&#215;)</td>
			<td>15140-163</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 ROCK inhibitor</td>
			<td>1254</td>
			<td>Tocris</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211; and Alexa Fluor 594&#8211;conjugated secondary antibodies</td>
			<td>A32744; A32754; A-11076; A32790</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brachyury(T&#65289;</td>
			<td>ab20680</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nephrin</td>
			<td>GP-N2</td>
			<td>Progen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4</td>
			<td>AF1759</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX2</td>
			<td>71-6000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT1</td>
			<td>MAB4234</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM Molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment</td>
			<td>N-892012</td>
			<td>Iwai North America</td>
			<td>Basement membrane (BM) matrix 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial</td>
			<td>354277</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes and Other Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>A9418</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>D2438</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank&#8217;s balanced salt</td>
			<td>13150016</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade</td>
			<td>97065-058</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Ethanol is flammable and toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>431097</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>28906</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Distilled Water</td>
			<td>15230162</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>97062-208</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td>
			<td>25300-120</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating pipettes, individually wrapped</td>
			<td>29442-462</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-15R Centrifuge</td>
			<td>B99516</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>352097</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>352098</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoboxes</td>
			<td>3395465</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>For storing frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M7000</td>
			<td>AMF7000</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>100503-092</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>51030403</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera</td>
			<td>491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark nitrile gloves</td>
			<td>40101-346</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, large</td>
			<td>21905-049</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, small</td>
			<td>21905-026</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 precision barrier pipette tips</td>
			<td>P1096-FR</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 barrier pipette tips</td>
			<td>P1125</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 barrier pipette tips</td>
			<td>P1126</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 barrier pipette tips</td>
			<td>P1121</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 barrier pipette tips</td>
			<td>P1122</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 10 mL, individually wrapped</td>
			<td>356551</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 25 mL, individually wrapped</td>
			<td>356525</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 5 mL, individually wrapped</td>
			<td>356543</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip, 0.22 &#956;m, PES</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>1138W14</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>For aliquoting growth factors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 12-well plates</td>
			<td>353043</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated six-well plates</td>
			<td>353046</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR white techuni lab coat</td>
			<td>10141-342</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-beveled cell lifter</td>
			<td>3008</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions

Nierenerkrankungen betreffen mehr als 10% der Weltbevölkerung und kosten Milliarden von Dollar an Bundesausgaben. Die schwersten Formen der Nierenerkrankung und das eventuelle Nierenversagen im Endstadium werden oft durch die Schädigung der glomerulären Podozyten verursacht, bei denen es sich um die hochspezialisierten Epithelzellen handelt, die zusammen mit Endothelzellen und der glomerulären Basalmembran die Filtrationsbarriere der Niere bilden. Fortschritte in der Nierenmedizin wurden durch die begrenzte Verfügbarkeit von Primärgewebe und das Fehlen robuster Methoden zur Ableitung funktioneller menschlicher Nierenzellen wie Podozyten behindert. Die Fähigkeit, Podozyten aus erneuerbaren Quellen wie Stammzellen abzuleiten, könnte dazu beitragen, das aktuelle Verständnis der Mechanismen der menschlichen Nierenentwicklung und -krankheit zu verbessern und neue Werkzeuge für die therapeutische Entdeckung bereitzustellen. Ziel dieses Protokolls war es, eine Methode zu entwickeln, um reife, postmiotische Podozyten aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS) mit hoher Effizienz und Spezifität und unter chemisch definierten Bedingungen abzuleiten. Die mit dieser Methode produzierten hiPS-Zell-abgeleiteten Podozyten exprimieren linienspezifische Marker (einschließlich Nephrin, Podocin und Wilm-Tumor 1) und weisen die spezialisierten morphologischen Merkmale (einschließlich primärer und sekundärer Fußprozesse) auf, die mit reifen und funktionellen Podozyten verbunden sind. Interessanterweise fehlen diese spezialisierten Merkmale in der immortalisierten Podozytenzelllinie, die in diesem Bereich weit verbreitet ist, was darauf hindeutet, dass das hier beschriebene Protokoll menschliche Nierenpodozyten produziert, die einen entwicklungsreiferen Phänotyp aufweisen als die bestehenden Podozytenzelllinien, die typischerweise zur Untersuchung der menschlichen Nierenbiologie verwendet werden.

Ziel dieses Protokolls war es zu zeigen, dass reife menschliche Podozyten unter chemisch definierten Bedingungen aus hiPS-Zellen gewonnen werden können. Die in diesem Manuskript vorgestellten Daten wurden unter Verwendung der DU11 hiPS-Zelllinie17generiert, die zuerst getestet wurde und sich als frei von Mykoplasmen erwiesen hat. Es wurde auch eine Chromosomenanalyse durchgeführt, und die Zellen erwiesen sich als karyotypisch normal. Ausgehend von den undifferenzierten DU11 hiPS-Zellen wurde die...

Watch this Scientific Journal Video about Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions at JoVE.com

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Hier wird ein chemisch definiertes Protokoll zur Ableitung menschlicher Nierenpodozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen mit hoher Effizienz (>90%) und unabhängig von genetischen Manipulationen oder Subpopulationsselektion vorgestellt. Dieses Protokoll erzeugt den gewünschten Zelltyp innerhalb von 26 Tagen und könnte für Nephrotoxizitätstests und Krankheitsmodellierung nützlich sein.

Geführte Differenzierung reifer Nierenpodozyten aus human induzierten pluripotenten Stammzellen unter chemisch definierten Bedingungen

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

guided-differentiation-mature-kidney-podocytes-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.4K Aufrufe.  Duke University. Hier wird ein chemisch definiertes Protokoll zur Ableitung menschlicher Nierenpodozyten aus induzierten pluripotenten Stammzellen mit hoher Effizienz (>90%) und unabhängig von genetischen Manipulationen oder Subpopulationsselektion vorgestellt. Dieses Protokoll erzeugt den gewünschten Zelltyp innerhalb von 26 Tagen und könnte für Nephrotoxizitätstests und Krankheitsmodellierung nützlich sein.

Serie: Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Forschung

Biotechnik

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus menschlichen alveoläre Periost und Effekte von Vitamin D auf knochenbildenden Aktivität Periost-abgeleitete Zellen

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

Menschlichen pluripotenten Stammzelle-Kultur auf Polyvinyl Alkohol-Co-Itaconic Säure Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit Xeno-freien Bedingungen

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable diseases, for the reconstitution and regeneration of injured tissues and for the development of new drugs. Despite all the advantages related to the use of iPSCs, such as the low risk of rejection, the lessened ethical issues, and the possibility to obtain them from both young and old patients without any difference in their reprogramming potential, problems to overcome are still numerous. In fact, cell reprogramming conducted with viral and integrating viruses can cause infections and the introduction of required genes can induce a genomic instability of the recipient cell, impairing their use in clinic. In particular, there are many concerns about the use of c-Myc gene, well-known from several studies for its mutation-inducing activity. Fibroblasts have emerged as the suitable cell population for cellular reprogramming as they are easy to isolate and culture and are harvested by a minimally invasive skin punch biopsy. The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the whole procedure, from sample processing to obtain cell cultures, choice of reagents and supplies, cleaning and preparation, to cell reprogramming by the means of a commercial non-modified RNAs (NM-RNAs)-based reprogramming kit. The chosen reprogramming kit allows an effective reprogramming of human dermal fibroblast to iPSCs and small colonies can be seen as early as 24 h after the first transfection, even with modifications with the respect to the standard datasheet. The reprogramming procedure used in this protocol offers the advantage of a safe reprogramming, without the risk of infections caused by viral vector-based methods, reduces the cellular defense mechanisms, and allows the generation of xeno-free iPSCs, all critical features that are mandatory for further clinical applications.

Cell reprogramming requires the introduction of key genes, which regulate and maintain the pluripotent cell state. The protocol described enables the formation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) colonies from human dermal fibroblasts without viral/integrating methods but using non-modified RNAs (NM-RNAs) combined with immune evasion factors reducing cellular defense mechanisms.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can trigger cerebellar dysfunction. Most of the current knowledge about disease-related neuronal phenotypes is based on postmortem tissues, which makes understanding of disease progression and development difficult. Animal models and immortalized cell lines have also been used as models for neurodegenerative disorders. However, they do not fully recapitulate human disease. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have great potential for disease modeling and provide a valuable source for regenerative approaches. In recent years, the generation of cerebral organoids from patient-derived iPSCs improved the prospects for neurodegenerative disease modeling. However, protocols that produce large numbers of organoids and a high yield of mature neurons in 3D culture systems are lacking. The protocol presented is a new approach for reproducible and scalable generation of human iPSC-derived organoids under chemically-defined conditions using scalable single-use bioreactors, in which organoids acquire cerebellar identity. The generated organoids are characterized by the expression of specific markers at both mRNA and protein level. The analysis of specific groups of proteins allows the detection of different cerebellar cell populations, whose localization is important for the evaluation of organoid structure. Organoid cryosectioning and further immunostaining of organoid slices are used to evaluate the presence of specific cerebellar cell populations and their spatial organization.

This protocol describes a dynamic culture system to produce controlled size aggregates of human pluripotent stem cells and further stimulate differentiation in cerebellar organoids under chemically-defined and feeder-free conditions using a single-use bioreactor.

Skalierbare Generierung von reifen Zerebellar-Organoiden aus humanen pluripotenten Stammzellen und Charakterisierung durch Immunostainierung

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

Fibroblasten-abgeleitetes Human Engineered Connective Tissue für Screening-Anwendungen

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of functional models that can accurately predict human biological responses and nephrotoxicity. Advancements in kidney precision medicine could help overcome these limitations. However, previously established in vitro models of the human kidney glomerulus-the primary site for blood filtration and a key target of many diseases and drug toxicities-typically employ heterogeneous cell populations with limited functional characteristics and unmatched genetic backgrounds. These characteristics significantly limit their application for patient-specific disease modeling and therapeutic discovery. 
This paper presents a protocol that integrates human induced pluripotent stem (iPS) cell-derived glomerular epithelium (podocytes) and vascular endothelium from a single patient to engineer an isogenic and vascularized microfluidic kidney glomerulus chip. The resulting glomerulus chip is comprised of stem cell-derived endothelial and epithelial cell layers that express lineage-specific markers, produce basement membrane proteins, and form a tissue-tissue interface resembling the kidney's glomerular filtration barrier. The engineered glomerulus chip selectively filters molecules and recapitulates drug-induced kidney injury. The ability to reconstitute the structure and function of the kidney glomerulus using isogenic cell types creates the opportunity to model kidney disease with patient specificity and advance the utility of organs-on-chips for kidney precision medicine and related applications.

Presented here is a protocol to engineer a personalized organ-on-a-chip system that recapitulates the structure and function of the kidney glomerular filtration barrier by integrating genetically matched epithelial and vascular endothelial cells differentiated from human induced pluripotent stem cells. This bioengineered system can advance kidney precision medicine and related applications.

Isogener Nieren-Glomerulus-Chip aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study defined aspects of that organ in a tissue culture dish. The breadth and application of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived organoid research have advanced significantly to include the brain, retina, tear duct, heart, lung, intestine, pancreas, kidney, and blood vessels, among several other tissues. The development of methods for the generation of human microvessels, specifically, has opened the way for modeling human blood vessel development and disease in vitro and for the testing and analysis of new drugs or tissue tropism in virus infections, including SARS-CoV-2. Complex and lengthy protocols lacking visual guidance hamper the reproducibility of many stem cell-derived organoids. Additionally, the inherent stochasticity of organoid formation processes and self-organization necessitates the generation of optical protocols to advance the understanding of cell fate acquisition and programming. Here, a visually guided protocol is presented for the generation of 3D human blood vessel organoids (BVOs) engineered from hPSCs. Presenting a continuous basement membrane, vascular endothelial cells, and organized articulation with mural cells, BVOs exhibit the functional, morphological, and molecular features of human microvasculature. BVO formation is initiated through aggregate formation, followed by mesoderm and vascular induction. Vascular maturation and network formation are initiated and supported by embedding aggregates in a 3D collagen and solubilized basement membrane matrix. Human vessel networks form within 2-3 weeks and can be further grown in scalable culture systems. Importantly, BVOs transplanted into immunocompromised mice anastomose with the endogenous mouse circulation and specify into functional arteries, veins, and arterioles. The present visually guided protocol will advance human organoid research, particularly in relation to blood vessels in normal development, tissue vascularization, and disease.

This protocol describes the generation of self-organizing blood vessels from human pluripotent and induced pluripotent stem cells. These blood vessel networks exhibit an extensive and connected endothelial network surrounded by pericytes, smooth muscle actin, and a continuous basement membrane.

Erzeugung menschlicher Blutgefäß-Organoide aus pluripotenten Stammzellen

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...