Ce travail a été soutenu par l’école d’ingénierie Pratt de l’Université Duke, la Division de néphrologie de la Duke Medical School, un prix de recherche de chaire du département de médecine de l’Université Duke et un prix spécial de transition de carrière PDEP du Burroughs Wellcome Fund à S.M.. M.B a été soutenu par le programme de bourses de recherche pour diplômés de la National Science Foundation. Nous remercions le laboratoire Bursac de nous avoir généreusement fourni la lignée de cellules souches DU11 et le laboratoire Varghese de l’Université Duke d’avoir temporairement partagé leur installation de culture tissulaire avec notre groupe. Cette publication est dédiée à la professeure Laura L. Kiessling, professeure Novartis de chimie au Massachusetts Institute of Technology, à l’époque de son 60e anniversaire.

1. Préparation des réactifs
<ol><li>Diluer le supplément de milieux de culture cellulaire (CCM) 5x hiPS décongelé dans un milieu basal de culture cellulaire hiPS pour obtenir une solution 1x de CCM hiPS. REMARQUE: Le supplément de CCM surgelé 5x hiPS nécessite un processus de décongélation lent, idéalement à 4 ° C pour la nuit. Les aliquotes du CCM 1x hiPS peuvent être conservées jusqu’à 6 mois à -20 °C.</li>
	<li>Préparation de plaques à membrane basale (BM) matricielle 1 pour la culture cellulaire hiPS : Décongeler la matrice BM 1 pendant la nuit sur de la glace à 4 °C. Une fois décongelés, préparer les aliquotes avec les facteurs de dilution appropriés, comme suggéré par le fabricant. REMARQUE: En règle générale, les aliquotes sont préparées pour dilution ultérieure dans 25 mL de DMEM/F12 froid dans un tube conique de 50 mL suivi d’un mélange approfondi pour dissoudre complètement la matrice BM 1 et éviter la formation de cristaux résiduels.</li>
	<li>Transférer 1 mL de la solution BM matrix 1 dans chaque puits d’une plaque de 6 puits et incuber à 37 °C pendant 1-2 h ou à 4 °C pendant au moins 24 h, enveloppé dans un film de paraffine. Les plaques revêtues de la matrice BM 1 peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à 2 semaines.</li>
	<li>Préparation de la matrice à membrane basale (BM) 2 - plaques revêtues : Diluer des quantités appropriées de matrice BM 2 dans 9 mL d’eau distillée stérile pour préparer une concentration finale de 5 μg/mL. Ajouter 700 μL de la solution BM matrix 2 à chaque puits d’une plaque de 12 puits et incuber la plaque à température ambiante pendant 2 h ou pendant la nuit à 4 °C.</li>
	<li>Préparer des solutions sous forme de BMP7, d’Activine A et de VEGF à 100 μg/mL comme suit : reconstituer le BMP7 dans de l’eau distillée stérile contenant 0,1 % (p/vol) de BSA et reconstituer séparément l’activine A et le VEGF dans du PBS stérile contenant 0,1 % (p/vol) de BSA. Pour éviter les cycles fréquents de congélation-décongélation, préparez des aliquotes de 100 μL à partir de chaque solution d’élevage et conservez-les à -20 °C jusqu’à 6 mois.</li>
	<li>Préparer une solution mère de 10 mM de Y27632 en dissolvant 10 mg de Y27632 dans 3,079 mL d’eau distillée stérile. Aliquote 100 μL du stock et conserver à -20 °C jusqu’à 6 mois.</li>
	<li>Dissoudre 2 mg de CHIR99021 dans 143,4 μL de DMSO stérile pour préparer une solution mère de 30 mM. Préparer des aliquotes de 5 μL et conserver à -20 °C jusqu’à 1 mois (ou selon la recommandation du fabricant).</li>
	<li>Dissoudre 10 mg d’acide rétinoïque touttrans dans 3,33 mL de DMSO stérile. Préparer des aliquotes de 500 μL et conserver à -20 °C jusqu’à 6 mois.</li>
</ol>2. Préparation des milieux de culture
<ol><li>Préparer le milieu de différenciation du mésoderme en reconstituant les solutions mères correspondantes à une concentration finale de 100 ng/mL d’Activine A, de 3 μM CHIR99021, de 10 μM Y27632 et de 1x supplément sans sérum B27 dans un volume approprié de DMEM/12 avec un supplément de glutamine. REMARQUE: Le milieu de différenciation du mésoderme doit être fraîchement préparé avant les étapes de différenciation et à un volume approprié à l’échelle de l’expérience (généralement, 50 mL de milieu sont suffisants pour deux plaques de 12 puits).</li>
	<li>Préparer le milieu intermédiaire de différenciation du mésoderme en reconstituant les solutions mères correspondantes à une concentration finale de 100 ng/mL BMP7, 3 μM CHIR99021 et 1x supplément sans sérum B27 dans DMEM/F12 avec un supplément de glutamine. REMARQUE: Si nécessaire, le milieu peut être complété par 1% (vol / vol) de pénicilline-streptomycine. Réglez le volume du milieu en utilisant DMEM/F12 avec un supplément de glutamine. Ce milieu peut être préparé en grandes quantités; toutefois, il est recommandé de les conserver dans des aliquotes plus petites (p. ex., 45 mL dans des tubes coniques de 50 mL) pour éviter les cycles répétés de gel-dégel. Ce milieu peut être conservé à -20 °C jusqu’à 3 mois et peut être décongelé à 4 °C pendant la nuit avant utilisation.</li>
	<li>Préparer le milieu d’induction des podocytes en reconstituant à une concentration finale de 100 ng/mL de BMP7, 100 ng/mL d’activine A, de 50 ng/mL de VEGF, de 3 μM de CHIR99021, de 1x supplément sans sérum B27 et d’acide rétinoïque tout-trans de 0,1 μM dans du DMEM/F12 avec un supplément de glutamine. Protéger le milieu de la lumière (p. ex., en enveloppant le contenant avec du papier d’aluminium). REMARQUE: Ce milieu peut être préparé en grandes quantités et stocké dans l’obscurité à -20 ° C pendant 3 mois. Les aliquotes congelées doivent être décongelées pendant la nuit à 4 °C avant utilisation.</li>
	<li>Préparer 25 mL de solution neutralisante de trypsine en ajoutant 10 % (vol/vol) de FBS inactivé par la chaleur dans le DMEM/F12 et filtrer dans des conditions stériles.</li>
	<li>Pour le maintien post-différenciation des podocytes dérivés de cellules souches, préparer le milieu complet avec un milieu d’entretien des podocytes en ajoutant le supplément au milieu basal conformément aux directives du fabricant et conserver à 4 ° C jusqu’à deux semaines.</li>
</ol>3. Culture cellulaire hiPS sans mangeoire utilisant un milieu de culture cellulaire hiPS
<ol><li>Aspirer la solution résiduelle de la matrice BM 1 des plaques pré-enduites et laver les puits 3 fois avec 1 à 2 mL de DMEM/F12 réchauffé.</li>
	<li>Aspirer le CCM hiPS des cellules hiPS et rincer les cellules 3 fois avec du DMEM/F12 réchauffé. Ajouter 1 mL de solution chaude de détachement cellulaire et incuber pendant 1 min à 37 °C pour aider à dissocier les cellules. Effectuez une inspection visuelle des cellules sous un microscope de culture tissulaire et assurez-vous que les bords des colonies cellulaires semblent arrondis, puis aspirez rapidement la solution de détachement cellulaire des cellules (en veillant à ce que les colonies cellulaires soient toujours attachées à la plaque, bien que lâchement). Rincez doucement les cellules une fois avec DMEM/F12 pour éliminer la solution de détachement cellulaire.</li>
	<li>Ajouter 3 mL de CCM hiPS aux cellules hiPS (dans chaque puits d’une plaque de 6 puits) qui ont été traitées avec la solution de détachement cellulaire. Grattez les colonies à l’aide d’un élévateur de cellules et pipettez doucement la suspension de cellules de haut en bas pour déloger les cellules faiblement adhérentes. Lavez soigneusement la plaque pour vous assurer que toutes les cellules sont récoltées. REMARQUE: L’utilisation d’une pipette de 5 mL est recommandée pour éviter un cisaillement excessif sur les cellules.</li>
	<li>Transférer 0,5 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits d’une nouvelle plaque de 6 puits revêtue de matrice BM 1 contenant 2 mL de CCM hiPS par puits. Déplacez la plaque en figure huit pour répartir les colonies cellulaires dans les puits et incuber à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. Rafraîchissez le milieu tous les jours jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à être passées ou utilisées pour l’expérience de différenciation (environ 70 % de confluence). REMARQUE: La taille idéale de la colonie pour le passage de routine des CS IPS se situe entre 200 et 500 μm dans des conditions sans mangeoire en utilisant hiPS CCM (sans inhibiteur de ROCK). Si les cellules sont individualisées pendant le traitement avec des enzymes de dissociation ou des tampons, le CCM hiPS peut être complété par un inhibiteur de ROCK (par exemple, 10 μM Y27632) pour améliorer la viabilité cellulaire.</li>
</ol>4. Différenciation des cellules hiPS en cellules mésodermiques (jours 0-2)
<ol><li>Alors que les cultures cellulaires hiPS sont en phase de croissance exponentielle (environ dans les 4 jours suivant la culture après le passage, et environ 70% de confluence), inspectez visuellement la présence de cellules spontanément différenciées à l’intérieur et autour des bords des colonies. Si nécessaire, grattez de manière aseptique les zones de différenciation.</li>
	<li>Aspirer hiPS CCM à partir de cellules hiPS et rincer les cellules 3 fois avec du DMEM/F12 chaud. Incuber les cellules avec 1 mL de tampon de dissociation cellulaire sans enzyme pendant 10 min à 37 °C et vérifier la dissociation au microscope. En raison des différences inhérentes entre les différentes lignées cellulaires hiPS, le temps d’incubation réel du tampon de dissociation cellulaire doit être déterminé pour une lignée cellulaire donnée.</li>
	<li>Grattez doucement le puits avec un élévateur de cellules pour déloger les cellules faiblement adhérentes et transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL, puis pipetez plusieurs fois pour individualiser les cellules hiPS.<ol>
<li>Porter la suspension cellulaire au volume de 15 mL avec du DMEM/F12 chaud et centrifuger pendant 5 min à 290 x g à température ambiante.</li>
		<li>Aspirer doucement le surnageant et resuspendez les cellules avec du DMEM/F12 chaud pour une autre série de centrifugation afin d’éliminer les composants résiduels de la matrice BM 1 et du tampon de dissociation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirer les cellules surnageantes et les réaporer dans 1 mL de milieu d’induction du mésoderme comme décrit ci-dessus. Compter le nombre total de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de coulter pour déterminer le volume approprié de milieu de différenciation du mésoderme nécessaire pour atteindre une concentration de 1 x10 5 cellules/mL.</li>
	<li>Aspirer la solution ECM à partir des plaques enduites de la matrice BM 2 et rincer les plaques deux fois avec du DMEM/F12 chaud. Mélangez doucement la suspension de la cellule hiPS en pipetant plusieurs fois. Transférer 1 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits des plaques de 12 puits revêtues de la matrice BM à 2, puis secouer doucement les plaques pour répartir les cellules plus uniformément.</li>
	<li>Incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. Rafraîchissez le milieu d’induction du mésoderme le lendemain. REMARQUE: Après 2 jours, les cellules mésodermiques dérivées des cellules hiPS seraient prêtes pour l’induction intermédiaire du mésoderme.</li>
</ol>5. Différenciation des cellules mésodermiques dérivées des cellules hiPS en mésoderme intermédiaire (jours 2-16)
<ol><li>Au jour 2 du protocole de différenciation, aspirer le milieu d’induction du mésoderme et reconstituer avec 1 mL par milieu d’induction du mésoderme intermédiaire.</li>
	<li>Rafraîchissez le milieu tous les jours pour maintenir un seuil précis de facteurs de croissance et de petites molécules pour les cellules métaboliquement actives. S’il y a une croissance cellulaire importante et un épuisement rapide des nutriments des milieux (indiqué par le jaunissement des milieux), le volume du milieu intermédiaire de différenciation du mésoderme peut être augmenté à 1,3 mL par puits des 12 plaques de puits.</li>
	<li>Culturez des cellules pendant 14 jours supplémentaires pour obtenir des cellules de mésoderme intermédiaires. Au jour 16, ces cellules peuvent être cryoconservées pour une utilisation ultérieure.</li>
</ol>6. Différenciation des cellules mésodermiques intermédiaires dérivées des cellules hiPS en podocytes (jours 16 à 21)
<ol><li>Rincer les cellules du mésoderme intermédiaire avec du DMEM/F12 chaud suivi d’une incubation des cellules avec 0,5 mL par puits de trypsine-EDTA à 0,05 % pendant 3 min à 37 °C. Effectuez une inspection visuelle pour vous assurer que les cellules commencent à se dissocier.</li>
	<li>Gratter les cellules à l’aide d’un élévateur de cellules et pipeter la suspension cellulaire plusieurs fois à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL pour obtenir des cellules individualisées (ou de petits amas). REMARQUE: À ce stade, assurez-vous que les cellules sont complètement dissociées car les cellules agrégées peuvent ne pas acquérir un phénotype différencié en phase terminale dans la chronologie du protocole.</li>
	<li>Ajouter environ 2 mL par puits de solution neutralisante de trypsine pour arrêter l’activité de la trypsine.</li>
	<li>Transférer les cellules dans un tube conique de 50 mL et porter le volume à 50 mL en utilisant DMEM/F12, puis centrifuger la suspension de la cellule pendant 5 min à 201 x g à température ambiante.</li>
	<li>Aspirer les cellules surnageantes et les réaporer dans le milieu d’induction des podocytes. Pour des résultats optimaux, assurez-vous d’une densité d’ensemencement finale d’environ 100 000 cellules/puits d’une plaque de 12 puits. Ajoutez la suspension cellulaire aux plaques à 2 couches de la matrice BM et secouez doucement la plaque pour aider à répartir les cellules plus uniformément.</li>
	<li>Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 et rafraîchir le milieu quotidiennement jusqu’à 5 jours pour obtenir des podocytes au jour 21. REMARQUE: Les podocytes dérivés de cellules hiPS résultants peuvent être maintenus en culture pendant 2 à 4 semaines supplémentaires en utilisant un milieu complet avec un milieu d’entretien des podocytes. Une fois dans un milieu d’entretien des podocytes, les cellules peuvent être nourries tous les deux jours et peuvent être utilisées pour des études ultérieures ou des analyses en aval.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Pluripotent+Stem+Cells:+History,+Mechanisms,+Technologies,+and+Applications.">Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).</li><li>Tabar, V., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+regenerative+medicine:+challenges+and+recent+progress.">Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282, 1145 (1998).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526, 564-568 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).</li><li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+mature+kidney+podocytes+and+establishment+of+a+Glomerulus+Chip.">Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip.</a> Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).</li><li>Pozzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta1+integrin+expression+by+podocytes+is+required+to+maintain+glomerular+structural+integrity.">Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity.</a> Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).</li><li>Kanasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+beta1-mediated+matrix+assembly+and+signaling+are+critical+for+the+normal+development+and+function+of+the+kidney+glomerulus.">Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus.</a> Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).</li><li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip.">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).</li><li>Torban, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX2+Activates+WNT4+Expression+during+Mammalian+Kidney+Development.">PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).</li><li>Reiser, J., Sever, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte+biology+and+pathogenesis+of+kidney+disease.">Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease.</a> Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).</li><li>Kuusniemi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Expression+of+Nephrin+in+Human+and+Pig.">Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig.</a> Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).</li><li>Guo, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WT1+is+a+key+regulator+of+podocyte+function:+reduced+expression+levels+cause+crescentic+glomerulonephritis+and+mesangial+sclerosis.">WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).</li><li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocin+localizes+in+the+kidney+to+the+slit+diaphragm+area.">Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area.</a> American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).</li><li>Shadrin, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiopatch+platform+enables+maturation+and+scale-up+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+engineered+heart+tissues.">Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues.</a> Nature Communications. 8, 1825 (2017).</li><li>Satoh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKC&#955;+maintains+the+integrity+of+the+glomerular+slit+diaphragm+through+trafficking+of+nephrin+to+the+cell+surface.">aPKC&#955; maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface.</a> The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).</li><li>Mae, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+and+robust+induction+of+nephrogenic+intermediate+mesoderm+from+human+pluripotent+stem+cells.">Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells.</a> Nature Communications. 4, 1367 (2013).</li><li>Reya, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signalling+in+stem+cells+and+cancer.">Wnt signalling in stem cells and cancer.</a> Nature. 434, 843-850 (2005).</li><li>Clevers, H., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt&#946;-Catenin+Signaling+and+Disease.">Wnt&#946;-Catenin Signaling and Disease.</a> Cell. 149, 1192-1205 (2012).</li><li>Ciampi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+podocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).</li><li>Fuente Mora, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Podocyte+and+Proximal+Tubule-Like+Cells+from+a+Mouse+Kidney-Derived+Stem+Cell+Line.">Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line.</a> Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).</li><li>Chuah, J. K. C., Zink, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+kidney+cells+and+organoids:+Recent+breakthroughs+and+emerging+applications.">Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications.</a> Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).</li><li>Becker, G. J., Hewitson, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+chronic+kidney+disease:+useful+but+not+perfect.">Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).</li></ol>

S.M. est l’auteur d’un brevet en instance pour des méthodes de génération de podocytes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes (demande de brevet américain 14/950859). Les autres auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Dans ce rapport, nous décrivons un protocole pour la génération de podocytes glomérulaires rénaux à partir de cellules hiPS. Les podocytes dérivés des cellules hiPS présentent des caractéristiques morphologiques et moléculaires associées au phénotype13du podocyte rénal mature. Dans des publications antérieures, nous avons montré que les podocytes dérivés des cellules hiPS peuvent imiter la structure et la fonction de filtration sélective du glomérule rénal lorsqu’ils sont co...

Les progrès de la culture de cellules souches pluripotentes humaines sont sur le point de révolutionner la médecine régénérative, la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments en fournissant aux chercheurs une source renouvelable et évolutive de matériel biologique qui peut être conçue pour obtenir presque n’importe quel type de cellule dans le corps humain1. Cette stratégie est particulièrement utile pour dériver des types de cellules spécialisées et fonctionnelles qui seraient autrement difficiles à obtenir. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPS)2,3,4,5 sont particulièrement attrayantes en raison de leur origine cellulaire somatique et du potentiel qu’elles représentent pour la médecine personnalisée. Cependant, le développement de méthodes pour dériver d’autres lignées cellulaires à partir de cellules hiPS reste difficile en raison de l’utilisation fréquente de conditions de culture mal définies, ce qui conduit à une faible efficacité et à une génération non spécifique de populations cellulaires hétérogènes6,7.
Présenté ici est une méthode pour la dérivation de podocytes rénaux matures à partir de cellules hiPS avec spécificité et haute efficacité dans des conditions chimiquement définies. En tenant compte des rôles de multiples facteurs dans le microenvironnement cellulaire, une stratégie de différenciation des cellules souches a été développée qui impliquait l’optimisation des facteurs solubles présentés dans le milieu de culture cellulaire ainsi que des facteurs insolubles, tels que les composants de la matrice extracellulaire ou les substrats adhésifs. Compte tenu de l’importance de la signalisation de l’intégrine dans le développement et la fonction des podocytes, l’expression des récepteurs de l’intégrine à la surface de la cellule a été initialement examinée. Les intégrines β1 étaient fortement exprimées non seulement dans les cellules hiPS, mais aussi dans leurs dérivés, y compris les cellules mésodermiques et les cellules mésodermiques intermédiaires8,9,10. Des expériences ultérieures ont confirmé que les ligands qui se lient aux intégrines β1 (y compris la laminine 511 ou le fragment de laminine 511-E8) soutiennent l’adhésion et la différenciation des cellules hiPS en podocytes lorsqu’ils sont utilisés en conjonction avec les milieux inductifs solubles décrits ci-dessous.
L’induction de l’engagement de la lignée cellulaire a été initiée en confirmant d’abord que les cellules hiPS cultivées sur les surfaces recouvertes de laminine pendant deux jours en présence d’un milieu contenant de l’activine A, chir99021 et Y27632 Inhibiteur de roche peuvent se différencier en cellules qui expriment les marqueurs mésodermiques précoces HAND1, goosecoid et brachyury8,11. Le traitement des cellules du mésoderme pendant 14 jours avec un milieu complété par la protéine morphogénétique osseuse 7 (BMP-7) et CHIR99021 a permis la dérivation de cellules mésodermiques intermédiaires qui exprimaient les marqueurs cellulaires néphron-progéniteurs de la tumeur de Wilm 1 (WT1), la protéine apparentée impaire 1 (OSR1)8,11et la protéine 2 du gène de boîte appariée (PAX2)12. Pour obtenir les podocytes glomérulaires rénaux matures, les cellules intermédiaires du mésoderme ont été traitées pendant 4 à 5 jours avec un nouveau milieu composé de BMP-7, d’activine A, de facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF), d’acide rétinoïque touttrans et de CHIR99021. La cytométrie en flux et l’immunocoloration ont été utilisées pour confirmer que >90% des cellules résultantes présentaient les caractéristiques moléculaires, morphologiques et fonctionnelles du podocyte rénal mature8,11,13. Ces caractéristiques comprennent le développement de processus de pied primaire et secondaire; l’expression de gènes spécifiques à la lignée podocytaire, y compris SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 et l’expression de protéines telles que la podocine, la néphrine et WT114,15,16. En outre, il a été constaté que les podocytes dérivés des cellules hiPS peuvent être maintenus en culture jusqu’à quatre semaines in vitro en utilisant un milieu8,11 disponible dans le commerce qui offre une flexibilité supplémentaire dans le calendrier des expériences en aval. Pour plus d’informations concernant les panels de cytométrie en flux utilisés pour déterminer la pureté des podocytes hiPS, veuillez vous référer à notre publication précédente11.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DU11 human iPS cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factors and Media Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinoic acid (500 mg)</td>
			<td>72262</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 serum-free supplement</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>04-0004</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>May show lot-to-lot variation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Medium Kit with CultureBoost-R</td>
			<td>4Z0-500-R</td>
			<td>Cell Systems</td>
			<td>Podocyte maintenance media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 with GlutaMAX supplement</td>
			<td>10565042</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>DMEM/F12 with glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated FBS</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human activin A</td>
			<td>PHC9564</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BMP7</td>
			<td>PHC9544</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF</td>
			<td>PHC9394</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium</td>
			<td>05850</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>hiPS cell culture media (CCM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin, liquid (100&#215;)</td>
			<td>15140-163</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 ROCK inhibitor</td>
			<td>1254</td>
			<td>Tocris</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488&#8211; and Alexa Fluor 594&#8211;conjugated secondary antibodies</td>
			<td>A32744; A32754; A-11076; A32790</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brachyury(T&#65289;</td>
			<td>ab20680</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nephrin</td>
			<td>GP-N2</td>
			<td>Progen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4</td>
			<td>AF1759</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX2</td>
			<td>71-6000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT1</td>
			<td>MAB4234</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM Molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment</td>
			<td>N-892012</td>
			<td>Iwai North America</td>
			<td>Basement membrane (BM) matrix 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial</td>
			<td>354277</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes and Other Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>A9418</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>D2438</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank&#8217;s balanced salt</td>
			<td>13150016</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade</td>
			<td>97065-058</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Ethanol is flammable and toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>431097</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>28906</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Distilled Water</td>
			<td>15230162</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>97062-208</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td>
			<td>25300-120</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating pipettes, individually wrapped</td>
			<td>29442-462</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti J-15R Centrifuge</td>
			<td>B99516</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tube, 15 mL</td>
			<td>352097</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tube, 50 mL</td>
			<td>352098</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoboxes</td>
			<td>3395465</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>For storing frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M7000</td>
			<td>AMF7000</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>100503-092</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>51030403</td>
			<td>Thermo/Life Technologies</td>
			<td>For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera</td>
			<td>491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark nitrile gloves</td>
			<td>40101-346</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, large</td>
			<td>21905-049</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, small</td>
			<td>21905-026</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10 precision barrier pipette tips</td>
			<td>P1096-FR</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 barrier pipette tips</td>
			<td>P1125</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000 barrier pipette tips</td>
			<td>P1126</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 barrier pipette tips</td>
			<td>P1121</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 barrier pipette tips</td>
			<td>P1122</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 10 mL, individually wrapped</td>
			<td>356551</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 25 mL, individually wrapped</td>
			<td>356525</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette, 5 mL, individually wrapped</td>
			<td>356543</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip, 0.22 &#956;m, PES</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>1138W14</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>For aliquoting growth factors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated 12-well plates</td>
			<td>353043</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture&#8211;treated six-well plates</td>
			<td>353046</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR white techuni lab coat</td>
			<td>10141-342</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-beveled cell lifter</td>
			<td>3008</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions

Les maladies rénales touchent plus de 10 % de la population mondiale et coûtent des milliards de dollars en dépenses fédérales. Les formes les plus graves de maladie rénale et éventuellement d’insuffisance rénale terminale sont souvent causées par les dommages aux podocytes glomérulaires, qui sont les cellules épithéliales hautement spécialisées qui fonctionnent avec les cellules endothéliales et la membrane basale glomérulaire pour former la barrière de filtration du rein. Les progrès de la médecine rénale ont été entravés par la disponibilité limitée de tissus primaires et le manque de méthodes robustes pour la dérivation de cellules rénales humaines fonctionnelles, telles que les podocytes. La capacité de dériver des podocytes à partir de sources renouvelables, telles que les cellules souches, pourrait aider à faire progresser la compréhension actuelle des mécanismes du développement et de la maladie des reins humains, ainsi que fournir de nouveaux outils pour la découverte thérapeutique. L’objectif de ce protocole était de développer une méthode pour dériver des podocytes post-mitotiques matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPS) avec une efficacité et une spécificité élevées, et dans des conditions chimiquement définies. Les podocytes dérivés des cellules hiPS produits par cette méthode expriment des marqueurs spécifiques à la lignée (y compris la néphrine, la podocine et la tumeur de Wilm 1) et présentent les caractéristiques morphologiques spécialisées (y compris les processus primaires et secondaires du pied) associés aux podocytes matures et fonctionnels. Curieusement, ces caractéristiques spécialisées sont notamment absentes dans la lignée cellulaire podocytaire immortalisée largement utilisée dans le domaine, ce qui suggère que le protocole décrit ici produit des podocytes rénaux humains qui ont un phénotype plus mature sur le plan du développement que les lignées cellulaires podocytaires existantes généralement utilisées pour étudier la biologie rénale humaine.

L’objectif de ce protocole était de démontrer que les podocytes humains matures peuvent être dérivés de cellules hiPS dans des conditions chimiquement définies. Les données présentées dans ce manuscrit ont été générées en utilisant la lignée cellulaire DU11 hiPS17, qui a d’abord été testée et s’est avérée exempte de mycoplasmes. Une analyse chromosomique a également été effectuée et les cellules se sont avérées normales sur le plan caryotypique. En commençant par l...

Watch this Scientific Journal Video about Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions at JoVE.com

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Présenté ici est un protocole chimiquement défini pour la dérivation des podocytes rénaux humains à partir de cellules souches pluripotentes induites avec une efficacité élevée (>90%) et indépendant des manipulations génétiques ou de la sélection de sous-populations. Ce protocole produit le type de cellule souhaité dans les 26 jours et pourrait être utile pour les tests de néphrotoxicité et la modélisation de la maladie.

Différenciation guidée des podocytes rénaux matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans des conditions chimiquement définies

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

guided-differentiation-mature-kidney-podocytes-from-human-induced

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.4K vues.  Duke University. Présenté ici est un protocole chimiquement défini pour la dérivation des podocytes rénaux humains à partir de cellules souches pluripotentes induites avec une efficacité élevée (>90%) et indépendant des manipulations génétiques ou de la sélection de sous-populations. Ce protocole produit le type de cellule souhaité dans les 26 jours et pourrait être utile pour les tests de néphrotoxicité et la modélisation de la maladie.

Vidéo: Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Le développement, l&#39;expansion et<em&gt; In vivo</em&gt; Suivi des cellules NK humaines à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et et induit des cellules souches pluripotentes (CISP)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Recherche

Bio-ingénierie

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Transplantation de progéniteurs myoangioblastes dérivés de cellules souches pluripotentes induites dans des modèles murins de régénération musculaire

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

Isolement des cellules souches mésenchymateuses du périoste alvéolaire humaine et les effets de la vitamine D sur activité ostéogène du périoste dérivées des cellules

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

Culture de cellules souches pluripotentes humaines sur Polyvinyl alcool-Co-itaconique acides Hydrogels avec raideur variable dans des Conditions sans Xeno

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable diseases, for the reconstitution and regeneration of injured tissues and for the development of new drugs. Despite all the advantages related to the use of iPSCs, such as the low risk of rejection, the lessened ethical issues, and the possibility to obtain them from both young and old patients without any difference in their reprogramming potential, problems to overcome are still numerous. In fact, cell reprogramming conducted with viral and integrating viruses can cause infections and the introduction of required genes can induce a genomic instability of the recipient cell, impairing their use in clinic. In particular, there are many concerns about the use of c-Myc gene, well-known from several studies for its mutation-inducing activity. Fibroblasts have emerged as the suitable cell population for cellular reprogramming as they are easy to isolate and culture and are harvested by a minimally invasive skin punch biopsy. The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the whole procedure, from sample processing to obtain cell cultures, choice of reagents and supplies, cleaning and preparation, to cell reprogramming by the means of a commercial non-modified RNAs (NM-RNAs)-based reprogramming kit. The chosen reprogramming kit allows an effective reprogramming of human dermal fibroblast to iPSCs and small colonies can be seen as early as 24 h after the first transfection, even with modifications with the respect to the standard datasheet. The reprogramming procedure used in this protocol offers the advantage of a safe reprogramming, without the risk of infections caused by viral vector-based methods, reduces the cellular defense mechanisms, and allows the generation of xeno-free iPSCs, all critical features that are mandatory for further clinical applications.

Cell reprogramming requires the introduction of key genes, which regulate and maintain the pluripotent cell state. The protocol described enables the formation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) colonies from human dermal fibroblasts without viral/integrating methods but using non-modified RNAs (NM-RNAs) combined with immune evasion factors reducing cellular defense mechanisms.

Isolement des fibroblastes dermiques humains adultes de la peau abdominale et génération de cellules souches pluripotentes induites à l'aide d'une méthode de non-intégration

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can trigger cerebellar dysfunction. Most of the current knowledge about disease-related neuronal phenotypes is based on postmortem tissues, which makes understanding of disease progression and development difficult. Animal models and immortalized cell lines have also been used as models for neurodegenerative disorders. However, they do not fully recapitulate human disease. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have great potential for disease modeling and provide a valuable source for regenerative approaches. In recent years, the generation of cerebral organoids from patient-derived iPSCs improved the prospects for neurodegenerative disease modeling. However, protocols that produce large numbers of organoids and a high yield of mature neurons in 3D culture systems are lacking. The protocol presented is a new approach for reproducible and scalable generation of human iPSC-derived organoids under chemically-defined conditions using scalable single-use bioreactors, in which organoids acquire cerebellar identity. The generated organoids are characterized by the expression of specific markers at both mRNA and protein level. The analysis of specific groups of proteins allows the detection of different cerebellar cell populations, whose localization is important for the evaluation of organoid structure. Organoid cryosectioning and further immunostaining of organoid slices are used to evaluate the presence of specific cerebellar cell populations and their spatial organization.

This protocol describes a dynamic culture system to produce controlled size aggregates of human pluripotent stem cells and further stimulate differentiation in cerebellar organoids under chemically-defined and feeder-free conditions using a single-use bioreactor.

Génération évolutive d’Organoïdes cérébellaires matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines et caractérisation par immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

Tissu conjonctif humain dérivé de fibroblastes pour les applications de dépistage

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of functional models that can accurately predict human biological responses and nephrotoxicity. Advancements in kidney precision medicine could help overcome these limitations. However, previously established in vitro models of the human kidney glomerulus-the primary site for blood filtration and a key target of many diseases and drug toxicities-typically employ heterogeneous cell populations with limited functional characteristics and unmatched genetic backgrounds. These characteristics significantly limit their application for patient-specific disease modeling and therapeutic discovery. 
This paper presents a protocol that integrates human induced pluripotent stem (iPS) cell-derived glomerular epithelium (podocytes) and vascular endothelium from a single patient to engineer an isogenic and vascularized microfluidic kidney glomerulus chip. The resulting glomerulus chip is comprised of stem cell-derived endothelial and epithelial cell layers that express lineage-specific markers, produce basement membrane proteins, and form a tissue-tissue interface resembling the kidney's glomerular filtration barrier. The engineered glomerulus chip selectively filters molecules and recapitulates drug-induced kidney injury. The ability to reconstitute the structure and function of the kidney glomerulus using isogenic cell types creates the opportunity to model kidney disease with patient specificity and advance the utility of organs-on-chips for kidney precision medicine and related applications.

Presented here is a protocol to engineer a personalized organ-on-a-chip system that recapitulates the structure and function of the kidney glomerular filtration barrier by integrating genetically matched epithelial and vascular endothelial cells differentiated from human induced pluripotent stem cells. This bioengineered system can advance kidney precision medicine and related applications.

Puce de glomérule rénal isogénique conçue à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Generation of Human Blood Vessel Organoids from Pluripotent Stem Cells

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study defined aspects of that organ in a tissue culture dish. The breadth and application of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived organoid research have advanced significantly to include the brain, retina, tear duct, heart, lung, intestine, pancreas, kidney, and blood vessels, among several other tissues. The development of methods for the generation of human microvessels, specifically, has opened the way for modeling human blood vessel development and disease in vitro and for the testing and analysis of new drugs or tissue tropism in virus infections, including SARS-CoV-2. Complex and lengthy protocols lacking visual guidance hamper the reproducibility of many stem cell-derived organoids. Additionally, the inherent stochasticity of organoid formation processes and self-organization necessitates the generation of optical protocols to advance the understanding of cell fate acquisition and programming. Here, a visually guided protocol is presented for the generation of 3D human blood vessel organoids (BVOs) engineered from hPSCs. Presenting a continuous basement membrane, vascular endothelial cells, and organized articulation with mural cells, BVOs exhibit the functional, morphological, and molecular features of human microvasculature. BVO formation is initiated through aggregate formation, followed by mesoderm and vascular induction. Vascular maturation and network formation are initiated and supported by embedding aggregates in a 3D collagen and solubilized basement membrane matrix. Human vessel networks form within 2-3 weeks and can be further grown in scalable culture systems. Importantly, BVOs transplanted into immunocompromised mice anastomose with the endogenous mouse circulation and specify into functional arteries, veins, and arterioles. The present visually guided protocol will advance human organoid research, particularly in relation to blood vessels in normal development, tissue vascularization, and disease.

This protocol describes the generation of self-organizing blood vessels from human pluripotent and induced pluripotent stem cells. These blood vessel networks exhibit an extensive and connected endothelial network surrounded by pericytes, smooth muscle actin, and a continuous basement membrane.

Génération d’organoïdes de vaisseaux sanguins humains à partir de cellules souches pluripotentes

An organoid is defined as an engineered multicellular in vitro tissue that mimics its corresponding in vivo organ such that it can be used to study ...