Nuestro protocolo permite probar el deslizamiento del metal para implantes ortopédicos contra el cartílago articular y así investigar los efectos de los implantes focales o hemiarthroplastia en la actividad biosintética de determinados conndracitos la principal ventaja de esta técnica es que proporciona una visión completa tanto de las propiedades tribológicas como de los efectos biológicos de la carga mecánica en el emparejamiento del cartílago. Esta técnica podría complementar los hallazgos clínicos después de procedimientos quirúrgicos como la implantación de implantes metálicos focales para tratar un defecto osteocondral de la rodilla o hemiarthroplastia de la cadera. Demostrando el procedimiento será Christopher Bauer un postdoctorado de mi laboratorio aquí en la Universidad del Danubio.
Utilice un tribómetro alternativo disponible comercialmente con un cilindro en la configuración de la placa, capacidades de carga vertical y carga ajustable y velocidad de deslizamiento. Además, se requiere una célula líquida para realizar las pruebas en una solución lubricante. Fije los cilindros osteocondrales en el soporte de la muestra inferior con el marcado alineado con la dirección deslizante.
Comience determinando la presión de contacto en el molibdeno de cromo cobalto en el sistema de cartílago utilizando una película de medición de presión. Coloque la película de medición de presión en la interfaz y aplique una carga estática durante 30 segundos para determinar la presión de contacto inicial, el tamaño del contacto y la forma. Monte los cilindros de molibdeno de cromo cobalto en la célula de carga superior.
Agregue la solución de prueba en la célula líquida para sumergir el cilindro osteocondral y cubrir la interfaz deslizante del cartílago metálico. Establezca parámetros de prueba como los descritos en la carrera de fuerza normal y la velocidad de deslizamiento que se mantendrán durante toda la prueba. Inicie el deslizamiento recíproco del cilindro metálico contra el cartílago articular sumergido en la solución lubricante.
Monitoreando el coeficiente de fricción a lo largo del experimento, termine el experimento. Después del período de prueba deseado retire el tapón osteocondral del portacólero enjuáguelo con PBS y guárdelo en medio hasta un análisis biológico posterior. Mantenga las muestras de control y la solución de prueba a temperatura ambiente durante la duración de la prueba y analícelas junto con las muestras que han estado expuestas a la carga mecánica.
Colocar, una placa de 24 pozos en una escala y cero. Enjuague el tapón osteocondral con PBS y colóquelo en un plato de Petri. Luego usa un bisturí para cortar el cartílago del injerto en una sola pieza bisect el cartílago en dos piezas iguales para que el área de contacto se distribuya por igual en las piezas del cartílago y mientras una mitad en aproximadamente un milímetro trozos en cubos.
Utilice la segunda mitad para el análisis de expresión génica transfiera el cartílago picado en un pozo de la placa preparada a 24 pozos y determine el peso tisular repita este proceso para cada muestra y agregue un mililitro de medio de crecimiento a cada pozo de la placa. Añadir 500 microlitros de solución XTT a cada pocús y mezclar luego incubar la placa a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante cuatro horas después de la incubación retire el sobrenadante y transfiérelo a un tubo de cinco mililitros. Extraiga el producto de tetrazolium añadiendo 500 microlitros de DMSO al tejido del cartílago en cada pocómo y aplique agitación continua durante una hora a temperatura ambiente, retire la solución DMSO y tire de ella con la solución XTT previamente recogida.
Transfiera 100 microlitros de cada muestra en triplicados a una placa de 96 pozos. Utilice un lector de placas para medir la absorbancia a una longitud de onda de 492 nanómetros y una longitud de onda de referencia de 690 nanómetros. Para aislar la pica del ARN la segunda mitad del tejido del cartílago obtenido del tapón osteocondral en pequeñas piezas, transfiera el tejido a un tubo que contenga perlas de cerámica y 300 microlitros de tampón con licencia.
Con 1%beta mercaptoetanol utilizar un lysate comercial para homogeneizar el tejido aplicando 6, 500 RPM durante 20 segundos cuatro veces con una fase de enfriamiento de 20 minutos después de cada carrera. Añadir 20 microlitros de proteinasa K y 580 microlitros de RNAs de agua libre a cada muestra, e incubarlos a 55 grados centígrados durante 30 minutos. Centrifugar las muestras durante tres minutos a 10.000 veces G y transfiera el sobrenadante a tubos de 1,5 mililitros.
Agregue 0,5 volúmenes de 90% de etanol a cada tubo y mezcle y luego transfiera 700 microlitros de la muestra a una columna de unión de ARN en un tubo de recogida de dos mililitros y centrifugarlo a 8.000 veces G durante 15 segundos. Deseche el flujo a través y repita el paso de centrifigación para el resto del izado. Agregue una de 350 microlitros de búfer RW uno a la columna.
Centrifugarlo a 8.000 veces G durante 15 segundos y desechar el flujo a través. Mezclar 10 microlitros de solución de material de ADN y 70 microlitros de Tampón RDD. Añadir la solución a la membrana de purificación de ARN e incubarla a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego añadir 350 microlitros de tampón RW uno a la columna.
Centrifugarlo a 8.000 veces G durante 15 segundos y desechar el flujo a través añadir 500 microlitros de Tampón RPE a la columna de purificación de ARN y Centrifugarlo a 8, 000 veces G durante 15 segundos deseche el flujo a través y para agregar otros 500 microlitros de Tampón RPE a la columna de purificación de ARN y luego centrifugarlo a 8.000 veces G durante dos minutos coloque la columna en un nuevo tubo de recolección de 1,5 mililitros y agregue 30 microlitros de ARN de agua libre centrifugar el tubo a 8.000 veces G durante un minuto, para aludir al ARN sintetizado cDNA usando un kit comercial descongelar y mezclar todas las regiones, añadir la muestra de ARN y realizar la reacción y el ciclor térmico como se describe en el manuscrito de texto. Añadir nueve microlitros de mezcla maestra RTQ PCR, y un microlitro de ADNc a cada pozo de una placa de 96 pozos con cada muestra en triplicados ilumina la placa PCR con aceite de techo y la centrifuga a 877 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius realizan RTQ PCR y una precisión y ciclor térmico. Según las instrucciones del manuscrito.
Antes de probar el área de contacto y la presión de contacto en la interfaz del cartílago metálico deben confirmarse mediante una película de medición de presión. La condición de carga fisiológica se puede confirmar comparando la huella obtenida con la inferencia de referencia para el contacto definido Un coeficiente de fricción bajo se puede mantener durante al menos una hora con un área de contacto migratoria. La composición y estructura de la matriz extracelular se puede determinar con la tinción de azafrán y O.
La intensidad de la tinción de azafrán y O es proporcional al contenido de proteoglicano. El contenido de proteoglicano varía según la superficie articular, pero debe ser uniforme a lo largo de toda la sección del tejido en muestras basales, mostrar extracción de glicosaminoglicanos que pueden ser contrarrestados por la carga mecánica. La actividad metabólica de los condrocitos articulares bovinos es independiente del sitio de recolección, pero muestra un aumento con la carga mecánica.
Los niveles de expresión génica de los genes específicos del cartílago aumentaron con condiciones de carga fisiológica. Mientras que los genes catabólicos están regulados con área de contacto estacionaria. Después de este procedimiento, se pueden realizar análisis adicionales incluyendo la determinación de productos de la tela del cartílago y el análisis de la superficie articular utilizando microscopía electrónica de barrido y además tratamos de optimizar la lubricación del cartílago articular en varios emparejamientos tribológicos.
