Unser Protokoll ermöglicht es, das Gleiten von Metall für orthopädische Implantate gegen Gelenkknorpel zu testen und damit die Auswirkungen von fokalen Implantaten oder Hemiarthroplastik auf die biosynthetische Aktivität bestimmter Chondrazyten zu untersuchen, der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie einen umfassenden Einblick sowohl in die tribologischen Eigenschaften als auch in die biologischen Wirkungen der mechanischen Belastung in der Knorpelpaarung bietet. Diese Technik könnte die klinischen Befunde nach chirurgischen Eingriffen wie der Implantation eines fokalen metallischen Implantats zur Behandlung eines Osteochonderdefekts des Knies oder einer Hemiarthroplastik der Hüfte ergänzen. Demonstriert wird das Verfahren von Christopher Bauer, einem Postdoc aus meinem Labor hier an der Donau-Universität.
Verwenden Sie ein handelsübliches Hubkolben-Tribometer mit Zylinder auf Plattenkonfiguration, vertikalen Lademöglichkeiten und einstellbarer Last- und Gleitgeschwindigkeit. Zusätzlich ist eine flüssige Zelle erforderlich, um die Tests in einer Schmierlösung durchzuführen. Fixieren Sie die Osteochonderzylinder am unteren Probenhalter mit der Markierung, die an der Gleitrichtung ausgerichtet ist.
Beginnen Sie mit der Bestimmung des Kontaktdrucks im Kobaltchrommolybdän auf knorpelsystem mit einem Druckmessfilm. Platzieren Sie den Druckmessfilm an der Schnittstelle, und wenden Sie eine statische Last für 30 Sekunden an, um den Anfangskontaktdruck, die Kontaktgröße und die Form zu bestimmen. Montieren Sie die Kobaltchrom-Molybdänzylinder auf die obere Wägezelle.
Fügen Sie die Testlösung in die flüssige Zelle ein, um den Osteochondralzylinder zu untertauchen und die Metallknorpelschiebeschnittstelle abzudecken. Legen Sie Prüfparameter fest, wie sie in normaler Krafthub- und Gleitgeschwindigkeit beschrieben sind und während des gesamten Tests beibehalten werden. Starten Sie das wechselseitige Schieben des Metallzylinders gegen den Gelenkknorpel, der in die Schmierlösung eingetaucht ist.
Überwachung des Reibungskoeffizienten während des gesamten Experiments, beenden Sie das Experiment. Nach der Wunschtestphase den Osteochondralstecker aus dem Probenhalter entfernen, mit PBS abspülen und bis zu einer weiteren biologischen Analyse im Medium aufbewahren. Halten Sie Die Kontrollproben und die Prüflösung für die Dauer der Prüfung bei Raumtemperatur und analysieren Sie sie zusammen mit den Proben, die mechanisch belastet wurden.
Platzieren Sie eine 24-Well-Platte auf einer Skala und null. Spülen Sie den Osteochondralstecker mit PBS und legen Sie ihn in eine Petrischale. Dann verwenden Sie ein Skalpell, um den Knorpel aus dem Transplantat in einem Stück zu schneiden, den Knorpel in zwei gleiche Stücke zu schneiden, so dass die Kontaktfläche gleichmäßig auf beide Knorpelstücke verteilt ist und eine Hälfte in etwa einen Millimeter gewürfelte Stücke zerkleinern.
Verwenden Sie die zweite Hälfte für die Genexpressionsanalyse übertragen Sie den gehackten Knorpel in einen Brunnen der vorbereiteten bei 24 Well Platte und bestimmen Sie das Gewebegewicht wiederholen Sie diesen Prozess für jede Probe und fügen Sie einen Milliliter Wachstumsmedium zu jedem Brunnen der Platte. Fügen Sie 500 Mikroliter XTT-Lösung zu jedem Brunnen und mischen Sie dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für vier Stunden nach der Inkubation entfernen Sie den Überstand und übertragen Sie es auf eine Fünf-Milliliter-Röhre. Extrahieren Sie das Tetrazolium-Produkt, indem Sie dem Knorpelgewebe in jedem Brunnen 500 Mikroliter DMSO hinzufügen und eine Stunde lang bei Raumtemperatur eine Stunde lang kontinuierlich rühren, die DMSO-Lösung entfernen und mit der zuvor gesammelten XTT-Lösung ziehen.
100 Mikroliter jeder Probe in Dreigezupfe auf eine 96-Well-Platte übertragen. Verwenden Sie einen Plattenleser, um die Absorption bei einer Wellenlänge von 492 Nanometern und einer Referenzwellenlänge von 690 Nanometern zu messen. Um das RNA-Hacken zu isolieren, wird die zweite Hälfte des Knorpelgewebes, das aus dem Osteochonder-Stecker in kleine Stücke gelangt, in eine Röhre mit Keramikperlen und 300 Mikroliter lizenzierten Puffers übertragen.
Mit 1%beta Mercaptoethanol verwenden Sie ein kommerzielles Lysat, um das Gewebe, das 6, 500 RPM für 20 Sekunden viermal mit einer 20-minütigen Kühlphase nach jedem Lauf auftragen, zu homogenisieren. Fügen Sie 20 Mikroliter Proteinase K und 580 Mikroliter RNAs freies Wasser zu jeder Probe hinzu und inkubieren Sie sie bei 55 Grad Celsius für 30 Minuten. Zentrifugieren Sie die Proben drei Minuten lang bei 10.000 mal G und übertragen Sie den Überstand auf 1,5 Milliliter-Röhren.
Fügen Sie 0,5 Volumen von 90% Ethanol in jedes Rohr und mischen Sie dann 700 Mikroliter der Probe in eine RNA-Bindungssäule in einem Zwei-Milliliter-Sammelrohr und zentrifugieren Sie es bei 8 000 mal G für 15 Sekunden. Entsorgen Sie den Durchfluss und wiederholen Sie den Zentrifigationsschritt für den Rest des Lysats. Fügen Sie der Spalte einen Puffer RW mit 350 Mikrolitern hinzu.
Zentrifugieren Sie es 15 Sekunden lang bei 8.000 mal G und entsorgen Sie den Durchfluss. Mischen Sie 10 Mikroliter DNA-Lagerlösung und 70 Mikroliter Puffer-RDD. Fügen Sie die Lösung der RNA-Reinigungsmembran hinzu und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur und fügen Sie dann 350 Mikroliter Puffer RW eins zur Säule hinzu.
Zentrifugieren Sie es 15 Sekunden lang bei 8.000 mal G und entsorgen Sie den Durchfluss 500 Mikroliter Puffer-RPE in die RNA-Reinigungskolonne und zentrifugieren Sie ihn bei 8, 000 mal G für 15 Sekunden entsorgen Sie den Durchfluss und fügen Sie weitere 500 Mikroliter Puffer RPE in die RNA-Reinigungskolonne dann Zentrifugieren Sie sie bei 8 000 mal G für zwei Minuten, legen Sie die Säule in ein neues 1,5-Milliliter-Sammelrohr und fügen Sie 30 Mikroliter RNAs freie Wasserzentrifuge das Rohr bei 8.000 mal G für eine Minute, um die RNA synthetisierte cDNA mit einem kommerziellen Kit Tauwetter und mischen alle Regionen, fügen Sie die RNA-Probe und führen die Reaktion und den thermischen Cycler, wie in der Texthandschrift beschrieben. Fügen Sie neun Mikroliter RTQ PCR Master-Mix, und ein Mikroliter cDNA zu jedem Brunnen einer 96 Brunnenplatte mit jeder Probe in Dreisrichtungen leuchtet die PCR-Platte mit Deckenöl und Zentrifuge es bei 877 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius führen RTQ PCR und eine Präzision und thermische Cycler. Nach Manuskriptanweisungen.
Vor der Prüfung müssen die Kontaktfläche und der Kontaktdruck an der Metallknorpelschnittstelle mit einem Druckmessfilm bestätigt werden. Physiologischer Belastungszustand kann dann durch Vergleich des erhaltenen Aufdrucks mit Referenzrückschluss für definierten Kontakt bestätigt werden Ein niedriger Reibungskoeffizient kann mindestens eine Stunde lang mit einer wandernden Kontaktfläche aufrechterhalten werden. Die extrazelluläre Matrixzusammensetzung und -struktur kann mit Safran- und O-Färbung bestimmt werden.
Die Intensität der Safran- und O-Färbung ist proportional zum Proteoglykangehalt. Der Proteoglykangehalt variiert über die Gelenkoberfläche, sollte aber im gesamten Gewebeabschnitt in Basisproben einheitlich sein, die Extraktion von Glykosaminoglykanen zeigen, die durch mechanische Belastung entgegengewirkt werden können. Die metabolische Aktivität der Rindergelenkchondrazyten ist unabhängig vom Ernteplatz, zeigt aber eine Zunahme mit mechanischer Belastung.
Die Genexpressionsniveaus von Knorpelspezifischen Genen nahmen mit physiologischen Belastungsbedingungen zu. Während katabole Gene mit stationärem Kontaktbereich hochreguliert werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können zusätzliche Analysen durchgeführt werden, einschließlich der Bestimmung von Knorpelbahnprodukten und der Analyse der Gelenkoberfläche mittels Rasterelektronenmikroskopie, und darüber hinaus versuchen wir, die Schmierung des Gelenkknorpels in verschiedenen tribologischen Paarungen zu optimieren.
