Notre protocole permet de tester le glissement du métal pour les implants orthopédiques contre le cartilage articulaire et ainsi d’étudier les effets des implants focaux ou de l’hémiarthroplastie sur l’activité biosynthétique de chondracytes particuliers le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit un aperçu complet à la fois des propriétés tribologiques et des effets biologiques de la charge mécanique dans l’appariement du cartilage. Cette technique pourrait compléter les résultats cliniques après des procédures chirurgicales comme l’implantation d’un implant métallique focal pour traiter un défaut ostéochondral du genou ou l’hémiarthroplastie de la hanche. Christopher Bauer, postdoc de mon laboratoire ici à l’Université du Danube, fera la démonstration de la procédure.
Utilisez un tribomètre réciproque disponible dans le commerce avec un cylindre sur la configuration de la plaque, des capacités de chargement verticale et une charge réglable et une vitesse de glissement. En outre, une cellule liquide est nécessaire pour effectuer les tests dans une solution lubrifiante. Fixer les cylindres ostéochondral sur le support inférieur de l’échantillon avec le marquage aligné avec la direction coulissante.
Commencez par déterminer la pression de contact dans le molybdène de chrome cobalt sur le système cartilagineux à l’aide d’un film de mesure de pression. Placez le film de mesure de pression à l’interface et appliquez une charge statique pendant 30 secondes pour déterminer la pression initiale de contact, la taille et la forme du contact. Montez les cylindres de molybdène de chrome cobalt sur la cellule de charge supérieure.
Ajoutez la solution d’essai dans la cellule liquide pour submerger le cylindre ostéochondral et couvrir l’interface coulissante du cartilage métallique. Définissez des paramètres d’essai tels que décrits dans la course de force normale et la vitesse de glissement qui seront maintenus tout au long de l’essai. Commencez à glisser réciproquement le cylindre métallique contre le cartilage articulaire immergé dans la solution lubrifiante.
Surveiller le coefficient de friction tout au long de l’expérience, mettre fin à l’expérience. Après la période d’essai du désir, retirez la fiche ostéochondrale du porte-échantillon rincez-la avec du PBS et rangez-la en milieu jusqu’à une analyse biologique plus poussée. Gardez les échantillons de contrôle et la solution d’essai à température ambiante pendant toute la durée de l’essai et analysez-les avec les échantillons qui ont été exposés à la charge mécanique.
Placer, une plaque de 24 puits sur une échelle et zéro. Rincez le bouchon ostéochondral avec du PBS et placez-le dans une boîte de Pétri. Ensuite, utilisez un scalpel pour couper le cartilage de la greffe en une seule pièce couper le cartilage en deux morceaux égaux de sorte que la zone de contact est également répartie sur les deux morceaux de cartilage et de hacher la moitié en environ un millimètre en cubes morceaux.
Utilisez la deuxième moitié pour l’analyse de l’expression génétique transférer le cartilage haché dans un puits de la plaque de puits préparé à 24 et de déterminer le poids des tissus répéter ce processus pour chaque échantillon et ajouter un millilitre de milieu de croissance à chaque puits de la plaque. Ajouter 500 microlitres de solution XTT à chaque puits et mélanger puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant quatre heures après l’incubation enlever le supernatant et le transférer dans un tube de cinq millilitres. Extraire le produit tétrazolium en ajoutant 500 microlitres de DMSO au tissu cartilagineux dans chaque puits et appliquer une agitation continue pendant une heure à température ambiante, enlever la solution DMSO et le tirer avec la solution XTT précédemment recueillies.
Transférer 100 microlitres de chaque échantillon en triplicates dans une plaque de puits de 96. Utilisez un lecteur de plaque pour mesurer l’absorption à une longueur d’onde de 492 nanomètres, et une longueur d’onde de référence de 690 nanomètres. Pour isoler l’ARN émincer la deuxième moitié du tissu cartilagineux obtenu à partir de la fiche ostéochondral en petits morceaux transférer le tissu à un tube contenant des perles de céramique et 300 microlitres de tampon autorisé.
Avec 1%bêta mercaptoéthanol utiliser un lysate commercial pour homogénéiser le tissu en appliquant 6500 RPM pendant 20 secondes quatre fois avec une phase de refroidissement de 20 minutes après chaque course. Ajouter 20 microlitres de proteinase K et 580 microlitres d’eau libre d’ARN à chaque échantillon, et les incuber à 55 degrés Celsius pendant 30 minutes. Centrifuger les échantillons pendant trois minutes à 10 000 fois G et transférer le supernatant dans des tubes de 1,5 millilitre.
Ajouter 0,5 volume de 90% d’éthanol à chaque tube et mélanger puis transférer 700 microlitres de l’échantillon à une colonne de liaison ARN dans un tube de collecte de deux millilitres et le centrifuger à 8000 fois G pendant 15 secondes. Jetez le flow-through et répétez l’étape de centrifugation pour le reste du lysate. Ajoutez un 350 microlitres de tampon RW à la colonne.
Centrifugez-le à 8000 fois G pendant 15 secondes et jetez le flux. Mélangez 10 microlitres de solution de stock d’ADN et 70 microlitres de RDD tampon. Ajouter la solution à la membrane de purification de l’ARN et l’incuber à température ambiante pendant 15 minutes, puis ajouter 350 microlitres de tampon RW un à la colonne.
Centrifugez-le à 8000 fois G pendant 15 secondes et jetez le flow-through ajouter 500 microlitres de RPE tampon à la colonne de purification de l’ARN et centrifugeuse à 8, 000 fois G pendant 15 secondes jeter le flux à travers et d’ajouter un autre 500 microlitres de RPE tampon à la colonne de purification de l’ARN, puis le centrifuger à 8000 fois G pendant deux minutes placer la colonne dans un nouveau tube de collecte de 1,5 millilitre et ajouter 30 microlitres de Les ARN libèrent la centrifugeuse d’eau du tube à 8 000 fois G pendant une minute, pour faire allusion à l’ARN synthétisé cDNA à l’aide d’un kit commercial dégeler et mélanger toutes les régions, ajouter l’échantillon d’ARN et effectuer la réaction et le cycleur thermique tel que décrit dans le manuscrit du texte. Ajoutez neuf microlitres de mélange principal RTQ PCR, et un microlitre de cDNA à chaque puits d’une plaque de puits de 96 avec chaque échantillon en triplicates brille la plaque PCR avec de l’huile de plafond et centrifugeuse à 877 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius effectuer RTQ PCR et un cycler de précision et thermique. Selon les instructions manuscrites.
Avant de tester la zone de contact et la pression de contact à l’interface du cartilage métallique doit être confirmée à l’aide d’un film de mesure de pression. L’état physiologique de chargement peut alors être confirmé en comparant l’empreinte obtenue avec l’inférence de référence pour le contact défini Un faible coefficient de frottement peut être maintenu pendant au moins une heure avec une zone de contact migrante. La composition et la structure extracellulaires de matrice peuvent être déterminées avec le safran et la coloration d’O.
L’intensité de la coloration du safran et de l’O est proportionnelle à la teneur en protéoglycane. La teneur en protéoglycanes varie sur la surface articulaire, mais doit être uniforme dans toute la section tissulaire dans les échantillons de base, montrer l’extraction de glycosaminoglycans qui peuvent être neutralisé par la charge mécanique. L’activité métabolique des chondracytes articulaires bovins est indépendante du site de récolte, mais montre une augmentation avec la charge mécanique.
Les niveaux d’expression génique des gènes spécifiques au cartilage ont augmenté avec des conditions physiologiques de chargement. Alors que les gènes cataboliques sont régulés avec une zone de contact stationnaire. Après cette procédure, l’analyse supplémentaire peut être exécutée comprenant la détermination des produits de toile de cartilage et l’analyse de la surface articulaire utilisant la microscopie électronique de balayage et en outre nous essayons d’optimiser la lubrification du cartilage articulaire dans divers appariements tribologiques.
