بروتوكول لدينا يجعل من الممكن لاختبار انزلاق المعادن لزرع العظام ضد الغضروف المفصلي وبالتالي التحقيق في آثار زرع البؤري أو رأب الهرمائية على النشاط البيولوجي من chondracytes معينة الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يوفر نظرة شاملة على كل من الخصائص الريبولوجية والآثار البيولوجية من التحميل الميكانيكي في الاقتران الغضاريف. قد تكمل هذه التقنية النتائج السريرية بعد العمليات الجراحية مثل زرع غرسات معدنية محورية لعلاج عيب في الركبة أو رأب الورك. إثبات الإجراء سيكون كريستوفر باور ما بعد الدكتوراه من مختبري هنا في جامعة الدانوب.
استخدم مقياس التمرن الترددي المتاح تجاريًا مع أسطوانة على تكوين اللوحة، وقدرات التحميل الرأسي والحمولة القابلة للتعديل وسرعة الانزلاق. بالإضافة إلى ذلك، مطلوب خلية سائلة لإجراء الاختبارات في حل التشحيم. إصلاح اسطوانات osteochondral على حامل عينة أسفل مع وضع علامة محاذاة مع اتجاه انزلاق.
تبدأ من خلال تحديد ضغط الاتصال في الموليبدينوم الكروم الكوبالت على نظام الغضاريف باستخدام فيلم قياس الضغط. ضع فيلم قياس الضغط على الواجهة، وقم بتطبيق حمل ثابت لمدة 30 ثانية لتحديد ضغط الاتصال الأولي وحجم الاتصال والشكل. قم بتركيب اسطوانات الموليبدينوم الكروم الكوبالت على خلية الحمل العليا.
أضف محلول الاختبار إلى الخلية السائلة لغمر أسطوانة osteochondral وتغطية واجهة انزلاق الغضاريف المعدنية. تعيين معلمات الاختبار مثل وصفها في السكتة الدماغية القوة العادية وسرعة الانزلاق التي سيتم الحفاظ عليها طوال الاختبار. بدء الانزلاق المتبادلة من اسطوانة معدنية ضد الغضروف المفصلي مغمورة في حل التشحيم.
مراقبة معامل الاحتكاك طوال التجربة، إنهاء التجربة. بعد فترة اختبار الرغبة إزالة المكونات osteochondral من حامل العينة شطفه مع برنامج تلفزيوني وتخزينه في المتوسط حتى مزيد من التحليل البيولوجي. الاحتفاظ بعينات التحكم وحل الاختبار في درجة حرارة الغرفة طوال مدة الاختبار وتحليلها مع العينات التي تعرضت للتحميل الميكانيكي.
مكان، لوحة 24 جيدا على مقياس وصفر ذلك. شطف المكونات osteochondral مع برنامج تلفزيوني ووضعها في طبق بيتري. ثم استخدام مشرط لقطع الغضروف من الكسب غير المشروع في قطعة واحدة قسم الغضروف في قطعتين متساويتين بحيث يتم توزيع منطقة التماس بالتساوي على كل من قطع الغضاريف واللوم نصف واحد في ما يقرب من قطعة ملليمتر مكعبات.
استخدام النصف الثاني لتحليل التعبير الجيني نقل الغضروف المفروم إلى بئر واحدة من أعد في 24 لوحة جيدا وتحديد وزن الأنسجة تكرار هذه العملية لكل عينة وإضافة ملليلتر واحد من متوسطة النمو إلى كل بئر من لوحة. إضافة 500 ميكرولتررس من حل XTT لكل بئر ويخلط ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع ساعات بعد الحضانة إزالة نافورل ونقله إلى أنبوب 5 ملليلتر. استخراج المنتج tetrazolium عن طريق إضافة 500 ميكرولترات من DMSO إلى أنسجة الغضروف في كل بئر وتطبيق الانفعالات المستمرة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وإزالة حل DMSO وسحبه مع حل XTT التي تم جمعها سابقا.
نقل 100 ميكرولترات من كل عينة في ثلاثات إلى لوحة 96 جيدا. استخدام قارئ لوحة لقياس امتصاص في الطول الموجي من 492 نانومتر، و طول موجة مرجعي من 690 نانومتر. لعزل mince RNA النصف الثاني من أنسجة الغضروف التي تم الحصول عليها من المكونات osteochondral في قطع صغيرة نقل الأنسجة إلى أنبوب يحتوي على الخرز السيراميك و 300 ميكرولترات من العازلة المرخصة.
مع 1٪ بيتا mercaptoethanol استخدام lysate التجارية لتجانس الأنسجة تطبيق 6، 500 دورة في الدقيقة لمدة 20 ثانية أربع مرات مع مرحلة التبريد 20 دقيقة بعد كل تشغيل. إضافة 20 ميكرولترات من البروتينات K و 580 ميكرولترات من الماء مجانا RNAs لكل عينة، واحتضان لهم في 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي العينات لمدة ثلاث دقائق في 10،000 مرات G ونقل فائقة أنابيب 1.5 ملليلتر.
إضافة 0.5 وحدات تخزين من 90٪ الإيثانول لكل أنبوب ومزيج ثم نقل 700 ميكرولترات من العينة إلى عمود الربط RNA في أنبوب جمع ملليلتر وطاردة مركزية في 8، 000 مرات G لمدة 15 ثانية. تجاهل تدفق من خلال وتكرار خطوة الطرد المركزي لبقية lysate. إضافة 350 ميكرولتررس من المخزن المؤقت RW واحد إلى العمود.
الطرد المركزي في 8،000 مرات G لمدة 15 ثانية وتجاهل تدفق من خلال. مزيج 10 ميكرولترات من محلول مخزون الحمض النووي و 70 ميكرولترات من العازلة RDD. إضافة الحل إلى غشاء تنقية RNA واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ثم إضافة 350 ميكرولترات من العازلة RW واحد إلى العمود.
الطرد المركزي في 8، 000 مرة G لمدة 15 ثانية وتجاهل تدفق من خلال إضافة 500 ميكرولترات من RPE العازلة إلى عمود تنقية الحمض النووي الريبي والطرد المركزي في 8، 000 مرات G لمدة 15 ثانية تجاهل تدفق من خلال وإضافة آخر 500 ميكرولترات من RPE العازلة إلى العمود تنقية RNA ثم الطرد المركزي في 8، 000 مرات G لمدة دقيقتين مكان العمود في أنبوب جمع 1.5 ملليلتر جديدة وإضافة 30 ميكرولترات من RNAs طرد مركزي المياه الحرة الأنبوب في 8، 000 مرات G لمدة دقيقة واحدة، لتلميح الحمض النووي الريبي توليف cDNA باستخدام ذوبان مجموعة تجارية وخلط جميع المناطق، إضافة عينة RNA وأداء رد فعل ودورة الحرارية كما هو موضح في مخطوطة النص. إضافة تسعة microliters من المزيج الرئيسي RTQ PCR، وواحد microliter من cDNA إلى كل بئر من 96 لوحة بئر مع كل عينة في ثلاث مرات يضيء لوحة PCR مع زيت السقف والطرد المركزي في 877 مرات G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية أداء RTQ PCR ودورة الدقة والحرارية. وفقا لاتجاهات المخطوطات.
قبل اختبار منطقة الاتصال والضغط الاتصال في واجهة الغضروف المعدني يجب أن تكون مؤكدة باستخدام فيلم قياس الضغط. ويمكن بعد ذلك تأكيد حالة التحميل الفسيولوجية عن طريق مقارنة البصمة التي تم الحصول عليها مع الاستدلال المرجعي للاتصال المحدد يمكن الحفاظ على معامل الاحتكاك المنخفض لمدة ساعة واحدة على الأقل مع منطقة الاتصال المهاجرة. يمكن تحديد تكوين المصفوفة خارج الخلية والهيكل مع الزعفران و O تلطيخ.
كثافة الزعفران و O تلطيخ يتناسب مع محتوى proteoglycan. محتوى proteoglycan يختلف على سطح المفصل ولكن ينبغي أن تكون موحدة في جميع أنحاء قسم الأنسجة في عينات خط الأساس، وتظهر استخراج الجليكوسامينوغلوليكانات التي يمكن التصدي لها عن طريق التحميل الميكانيكية. النشاط الأيضي من الأبقار المفصلية هي مستقلة عن موقع الحصاد ولكن يظهر زيادة مع التحميل الميكانيكية.
زاد ال [مورث ستيولوجد اّيند رسّمّسّتد رسّاغوند رسّاية]. في حين أن الجينات تقويضي هي حتى- تنظيم مع منطقة اتصال ثابتة. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء تحليل إضافي بما في ذلك تحديد منتجات الويب الغضاريف وتحليل السطح المفصلي باستخدام المجهر الإلكتروني المسح وعلاوة على ذلك نحن نحاول تحسين تزييت الغضروف المفصلي في مختلف أزواج تريبولوجي.
