Il nostro protocollo consente di testare lo scorrimento del metallo per gli impianti ortopedici contro la cartilagine articolare e quindi di indagare gli effetti degli impianti focali o dell'emiartroplastica sull'attività biosintetica di particolari chondraciti il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce una visione completa sia delle proprietà tribologiche che degli effetti biologici del carico meccanico nell'accoppiamento della cartilagine. Questa tecnica potrebbe completare i risultati clinici dopo procedure chirurgiche come l'impianto di impianti metallici focali per trattare un difetto osteocondrale del ginocchio o l'emiartroplastica dell'anca. A dimostrare la procedura sarà Christopher Bauer un postdoc del mio laboratorio qui all'Università del Danubio.
Utilizza un tribometro alternativo disponibile in commercio con configurazione cilindro su piastra, capacità di carico verticale e carico regolabile e velocità di scorrimento. Inoltre, è necessaria una cella liquida per eseguire i test in una soluzione lubrificante. Fissare i cilindri osteocondriali sul supporto del campione inferiore con la marcatura allineata con la direzione di scorrimento.
Iniziare determinando la pressione di contatto nel molibdeno di cromo cobalto sul sistema di cartilagine utilizzando una pellicola di misurazione della pressione. Posizionare la pellicola di misurazione della pressione sull'interfaccia e applicare un carico statico per 30 secondi per determinare la pressione di contatto iniziale, le dimensioni e la forma del contatto. Montare i cilindri di molibdeno di cromo cobalto sulla cella di carico superiore.
Aggiungere la soluzione di prova nella cella liquida per immergere il cilindro osteocondrale e coprire l'interfaccia scorrevole della cartilagine metallica. Impostare parametri di prova come descritto nella corsa di forza normale e nella velocità di scorrimento che verranno mantenuti durante la prova. Avviare lo scorrimento reciproco del cilindro metallico contro la cartilagine articolare immersa nella soluzione lubrificante.
Monitorando il coefficiente di attrito durante l'esperimento, terminare l'esperimento. Dopo il periodo di test del desiderio rimuovere la spina osteocondrale dal portacampioni risciacquarla con PBS e conservarla in mezzo fino a ulteriori analisi biologiche. Conservare i campioni di controllo e la soluzione di prova a temperatura ambiente per tutta la durata del test e analizzarli insieme ai campioni esposti al carico meccanico.
Posizionare, una piastra di 24 pozzeri su una scala e azzerarla. Risciacquare la spina osteocondrale con PBS e posizionare in una piastra di Petri. Quindi utilizzare un bisturi per tagliare la cartilagine dall'innesto in un unico pezzo tagliare la cartilagine in due pezzi uguali in modo che l'area di contatto sia equamente distribuita su entrambi i pezzi di cartilagine e tritare la metà in circa un millimetro pezzi a cubetti.
Utilizzare la seconda metà per l'analisi dell'espressione genica trasferire la cartilagine tritata in un pozzetto della piastra di pozzo preparata a 24 pozzetti e determinare il peso del tessuto ripetere questo processo per ogni campione e aggiungere un millilitro di mezzo di crescita a ciascun pozzo della piastra. Aggiungere 500 microlitri di soluzione XTT ad ogni pozzo e mescolare quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per quattro ore dopo l'incubazione rimuovere il supernatante e trasferirlo in un tubo da cinque millilitri. Estrarre il prodotto tetrazolio aggiungendo 500 microlitri di DMSO al tessuto cartilagineo in ogni pozzo e applicare un'agitazione continua per un'ora a temperatura ambiente, rimuovere la soluzione DMSO e tirarla con la soluzione XTT precedentemente raccolta.
Trasferire 100 microlitri di ogni campione in triplicati in una piastra da 96 pozza. Usa un lettore di lastre per misurare l'assorbanza ad una lunghezza d'onda di 492 nanometri e una lunghezza d'onda di riferimento di 690 nanometri. Per isolare l'RNA macinato la seconda metà del tessuto cartilagineo ottenuto dalla spina osteocondrale in piccoli pezzi trasferire il tessuto in un tubo contenente perline di ceramica e 300 microlitri di tampone concesso in licenza.
Con l'1%beta di mercaptoetanolo utilizzare un lisato commerciale per omogeneizzare il tessuto applicando 6.500 giri/min per 20 secondi quattro volte con una fase di raffreddamento di 20 minuti dopo ogni corsa. Aggiungere 20 microlitri di proteinasi K e 580 microlitri di acqua libera RNA a ciascun campione e incubarli a 55 gradi Celsius per 30 minuti. Centrifugare i campioni per tre minuti a 10.000 volte G e trasferire il supernatante in tubi da 1,5 millilitri.
Aggiungere 0,5 volumi di 90%etanolo a ciascun tubo e mescolare, quindi trasferire 700 microlitri del campione a una colonna di legame RNA in un tubo di raccolta a due millilitri e centrifugarlo a 8.000 volte G per 15 secondi. Scartare il flusso e ripetere la fase di centrifigazione per il resto del lisato. Aggiungere un 350 microlitri di buffer RW uno alla colonna.
Centrifugarlo a 8.000 volte G per 15 secondi e scartare il flusso. Mescolare 10 microlitri di soluzione di stock di DNA e 70 microlitri di RDD tampone. Aggiungere la soluzione alla membrana di purificazione dell'RNA e incubarla a temperatura ambiente per 15 minuti, quindi aggiungere 350 microlitri di tampone RW uno alla colonna.
Centrifugarlo a 8.000 volte G per 15 secondi e scartare il flusso-through aggiungere 500 microlitri di tampone RPE alla colonna di purificazione dell'RNA e Centrifugarlo a 8, 000 volte G per 15 secondi scartare il flusso e aggiungere altri 500 microlitri di tampone RPE alla colonna di purificazione dell'RNA, quindi centrifugarlo a 8.000 volte G per due minuti posizionare la colonna in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 millilitri e aggiungere 30 microlitri di Gli RNA liberano l'acqua centrifugando il tubo a 8.000 volte G per un minuto, per alludere all'RNA sintetizzato cDNA usando un kit commerciale scongelare e mescolare tutte le regioni, aggiungere il campione di RNA ed eseguire la reazione e il ciclore termico come descritto nel manoscritto di testo. Aggiungere nove microlitri di RTQ PCR master mix e un microlitro di cDNA a ogni pozzo di una piastra di 96 pozzetti con ogni campione in triplicati illumina la piastra PCR con olio da soffitto e centrifugarla a 877 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius eseguire RTQ PCR e un ciclore di precisione e termico. Secondo le indicazioni manoscritte.
Prima di testare l'area di contatto e la pressione di contatto nell'interfaccia della cartilagine metallica devono essere confermati utilizzando una pellicola di misurazione della pressione. La condizione fisiologica di carico può quindi essere confermata confrontando l'impronta ottenuta con l'inferenza di riferimento per un contatto definito Un basso coefficiente di attrito può essere mantenuto per almeno un'ora con un'area di contatto migratoria. La composizione e la struttura della matrice extracellulare possono essere determinate con colorazione zafferano e O.
L'intensità della colorazione dello zafferano e o è proporzionale al contenuto di proteoglicano. Il contenuto di proteoglicano varia sulla superficie articolare, ma deve essere uniforme in tutta la sezione tissutale nei campioni di base, mostrare l'estrazione di glicosaminoglicani che possono essere contrastati dal carico meccanico. L'attività metabolica dei chondraciti articolari bovini è indipendente dal sito di raccolta ma mostra un aumento con il carico meccanico.
I livelli di espressione genica dei geni specifici della cartilagine sono aumentati con le condizioni fisiologiche di carico. Mentre i geni catabolici sono regolati con l'area di contatto stazionaria. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire ulteriori analisi tra cui la determinazione dei prodotti web della cartilagine e l'analisi della superficie articolare utilizzando la microscopia elettronica a scansione e inoltre cerchiamo di ottimizzare la lubrificazione della cartilagine articolare in vari accoppiamenti tribologici.
