El objetivo general de este presente video es explicar el protocolo de una doble inyección directa de sangre en la cisterna magna como un modelo de hemorragia subaracnoidea. La fisiología de la hemorragia subaracnoidea a menudo se debe a una ruptura de un aneurisma. Y primero hacemos la extravasación de sangre en el compartimiento entre el cerebro y el tejido que cubre el cerebro.
Este compartimiento es el espacio subaracnoideo. La hemorragia subaracnoidea representa hasta el 7% de todos los casos de huelga. La mortalidad varía entre el 30 y el 50% en los estudios basados en la población y los sobrevivientes de hemorragias subaracnoideas suelen experimentar secuelas cognitivas como déficits de memoria, astenia o trastornos del estado de ánimo.
La principal causa en la alta prevalencia de un mal resultado es la isquemia cerebral. Los estudios hicieron un vínculo entre la aparición de isquemia en la vasoconstricción de las grandes arterias cerebrales, llamada vasoespasmo microscópico que se puede detectar en la mayoría de los pacientes entre el cuarto y el decimoquinto día después del primer evento de distensión abdominal. Debido a la ineficiencia de las opciones terapéuticas actuales, hay una necesidad médica obvia para una mejor comprensión de los eventos patológicos.
Se debe probar la hemorragia subaracnoidea que acompaña y las nuevas dianas terapéuticas, pero esto requiere modelos animales variados y estandarizados. Es probable que sea difícil la ruptura del aneurisma intercraneal mayormente responsable de la hemorragia subaracnoidea en humanos. En animales, las principales dificultades residen en la incidencia de control de hemorragia y distribución sanguínea, pero estudios recientes se centran en el desarrollo de modelos más redicive de modelos de hemorragia subaracnoidea.
Aquí representan un modelo de ratón estandarizado de dos inyecciones consecutivas de sangre arterial autóloga de nuestros dos días en la cisterna magna. Las principales ventajas de este modelo son dominar de forma reproducible un procedimiento quirúrgico no invasivo, adaptar la calidad y cantidad de la sangre inyectada, y reforzar el evento hemorrágico sin aumentar drásticamente la presión intracraneal. Antes del comienzo de la cirugía, usted tiene que poner otro gran número de capilares de vidrio mediante el uso de un tirador de micropipeta.
La pipeta de inyección debe presentar un diámetro interior de 0,86 milímetros y un diámetro exterior de 0,5 milímetros. Preparar el líquido cefalorraquídeo artificial para una afección falsa, como se indica en el protocolo escrito. Debe darse cuenta de este líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado con un aparato de filtro de 0,22 micras.
El primer paso de nuestro modelo de hemorragia subaracnoidea consiste en el aislamiento de la arteria carótida a lo largo de la tráquea y la recolección del máximo de sangre de la punción de la arteria carótida. Después de la anestesia por isoflurano, compruebe la falta de reflejos sujetando una o dos extremidades posteriores para permitir el ajuste del procedimiento experimental. Codifque una jeringa de un milímetro con Eprin utilizando una aguja de calibre 26.
Esto evitará la coagulación de la sangre durante los siguientes pasos. Pese cada ratón con precisión utilizando una balanza electrónica. En el estudio actual, ratones tendrían peso corporal dentro del rango de 20 Para 25 gramos justo antes de la cirugía.
Como se explicó anteriormente, la anestesia inducida del ratón operado y luego afeitar el cuello y el espacio entre cada oreja por medio de un cortador eléctrico adecuado. Compruebe que el ratón está durmiendo y la cabeza del ratón está bien bloqueada. Inyectar por vía subcutánea 100 microlitros de buprenorfina a 0,1 miligramos por kilo con una aguja de calibre 26 en la parte inferior de la espalda para evitar el dolor después del despertar.
Evite la sequedad de los ojos con un gel líquido protector y mantenga una temperatura intraductal de 37 grados con una manta eléctrica regulada automáticamente. Antes de tratar el área afeitada con una solución antiséptica, todos los instrumentos que tocan el tejido han sido esterilizados y se manejaron asépticamente. El primer día, corte una incisión de un centímetro de largo en el cuello posterior, seguido de la separación de los músculos a lo largo de la línea media, para acceder a la cisterna magna.
Corte la punta de la pipeta de vidrio vacía con tijeras delgadas. A continuación, adáptese a una jeringa conectada a un conector de silicio flexible. Luego transfiera 60 microlitros de sangre o líquido cefalorraquídeo artificial en un tubo de 0,5 mililitros utilizando una micropipeta de precisión Succionar la pipeta de vidrio, los 60 microlitros de sangre para la condición de hemorragia subaracnoidea o 60 microlitros de líquido cefalorraquídeo artificial para la afección falsa.
Para inyección, inserte la pipeta en el marco estereotáctico utilizando, por ejemplo, nuestro anillo o a y acercarse lentamente a la punta de la pipeta a la membrana en la interfaz con la cisterna magna. Inserte lentamente la punta de la pipeta a través de la membrana atlanto-occipital en la cisterna magna utilizando un micromanipulador del marco estereotáctico. Conecte la pipeta a la jeringa previamente llena, lista para la inducción de presión.
Inyectar por presión a una velocidad baja alrededor de 10 microlitros por minuto para evitar la hipertensión intracraneal aguda. Durante la inyección, controle estrechamente la frecuencia respiratoria y la temperatura rectal. Al final de la inyección, retire cuidadosamente la pipeta con el micromanipulador y tenga cuidado visualmente de que no haya fugas durante la extracción.
Alcanza la homeostasis y realiza dos suturas con hilo suturado trenzado no absorbible. Inmediatamente después de la cirugía, aísle y coloque el ratón en declive decúbito y cubra con una manta de supervivencia en una caja abierta durante la recuperación. Después de 24 horas, induzca la anestesia de nuevo, instale el ratón en el marco estereotáctico como el día anterior y retire con cuidado las suturas con micro-tijeras.
Preparar como antes aséptico de la membrana atlanto-occipital, aplicando sobre la zona afeitada y solución aséptica con una varilla de algodón. Inyectar, como el día anterior, 30 microlitros de sangre o líquido cefalorraquídeo artificial a una velocidad baja. Como ya se ha mencionado, controlar la frecuencia respiratoria y la temperatura rectal.
Al final de la inyección, quite cuidadosamente la pipeta y controle la ausencia de fuga de sangre durante la retirada. Alcanza la homeostasis y realiza dos suturas con un hilo de sutura absorbible trenzado. Desde el primer día después de la cirugía hasta el día del sacrificio, el peso corporal debe evaluarse diariamente como un indicador sensible para el bienestar general.
Mostró una reducción significativa del aumento de peso corporal en hemorragia subaracnoidea, en comparación con animales falsos, lo que sugiere un proceso de recuperación de actividad de larga duración y eventos patológicos prolongados, hemorragia post subaracnoidea. ¿Por qué la mortalidad no está en condiciones falsas? La mortalidad es cercana al 30% en el séptimo día en la condición de hemorragia subaracnoidea, con la mayoría de los animales muriendo en el uno o el cuarto día después de la cirugía.
Entre los puntos finales humanos, se observa una pérdida de peso significativa superior al 15% del peso inicial. Una postura encorvada, movimientos lentos, heridas, vocalizaciones anormales o agresiones significativas son también signos de que el animal está sufriendo. Si aparece alguno de estos signos o una combinación de signos, el seguimiento del animal se refuerza en cuestión de horas que siguen su apariencia.
Si la condición del animal empeora en la hora que sigue o no mejora en 48 horas, se considerará que se alcanza un nivel de sufrimiento intolerable y se lleva a cabo la matanza. En este ejemplo en el primer día de la cirugía, se puede observar desde un cerebro de muestra, coágulos de sangre a lo largo de las grandes arterias del polígono Willis en sujeto de hemorragia subaracnoidea. En el día cinco después de la cirugía y antes del sacrificio, la inyección de tinta india intervascular permite la detección de vasoespasmo macroscópico correspondiente a la vasoconstricción de grandes arterias cerebelosas, Coloración de rodajas cerebrales con hematoxilina y eosina permite la medición de vasoespasmo cerebral.
Aquí, como se ilustra en esta micrografía fotográfica, se puede observar como un vasoespasmo de la arteria basilar. En este modelo de desvío de la inyección directa de sangre a la cisterna magna, hemos demostrado recientemente vasoespasmo cerebral de grandes arterias cerebrales, deposición fibrina vascular cerebral, y apoptosis celular, acompañada de alteraciones de las funciones sensoriales, motoras y cognitivas en ratones. Por lo tanto, hace que este modelo valide y se caracterice para eventos a corto y largo plazo, hemorragia post subaracnoidea.
Debe ser ideal para la identificación prospectiva de nuevas dianas y para estudios sobre estrategias terapéuticas eficientes contra las complicaciones asociadas a la hemorragia subaracnoidea.
