La mutagénesis de intercambio alélico de casete floxado es un método importante porque la deleción genética es una herramienta valiosa que se puede utilizar para comprender la función de los productos genéticos. La principal ventaja de esta técnica es que permite la deleción de genes dirigidos sin infligir efectos polares sobre genes posteriores. Identificar aproximadamente tres regiones de kilobase directamente aguas arriba y aguas abajo del gen destinado a la deleción para servir como los cinco brazos de homología principal y tres primos para la recombinación homóloga y asignar imprimaciones como se indica en el protocolo de texto.
Amplifique las tres armas de kilobase cinco prime y tres de homología de primera calidad del ADN genómico clamidol recién extraído por PCR en una o dos reacciones para producir suficiente fragmento para su posterior ensamblaje de ADN. Después de purificar y concentrar los fragmentos de PCR como se describe en el protocolo de texto, digiere 500 nanogramos del vector pSUmC-4.0 en una reacción de 20 microlitros con una unidad de celda una y una unidad de SBF uno de acuerdo con el protocolo del fabricante. Combine el vector pSUmC-4.0 digerido y purificado y los cinco productos de PCR de brazo primo y tres de primera homología a una proporción de 0.01 picomoles vector a 0.09 picomoles de cada brazo de homología.
Montar los fragmentos en una reacción de ensamblaje de ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante. Transforma 50 microlitros de electrocompettente E.coli con un microlitro de la reacción del ensamblaje del ADN. Placa la E.coli transformada en placas de agar LB que contienen 100 microgramos por mililitro de espectinomicina.
Incubar las placas a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, las colonias de pantalla para la fluorescencia verde y roja utilizando un microscopio invertido de epifluorescencia. Se espera un total de cinco a 30 colonias por placa de agar.
Después de una incubación de cultivo líquido durante la noche de las colonias seleccionadas, confirme la inserción de cada brazo de homología en el vector utilizando las imprimaciones de cribado PCR para amplificar cada inserción. Las células McCoy de semillas que son fibroblastos de ratón que se utilizan normalmente para cultivar clamidia en dos placas de seis pozos como se describe en el protocolo de texto. En un tubo de 1,5 mililitros, agregue los cuerpos elementales de serovar L2 de tipo silvestre C.trachomatis, o EBs, a un volumen que sea suficiente para infectar 12 pozos de una placa de seis pozos en un MOI de dos.
Pele el EBs a más de 20.000 veces g durante 30 minutos y deseche el sobrenadante. Inicie la transformación clamidial resuspendiendo suavemente los EB en 600 microlitros de tamampón de cloruro de calcio. A continuación, añadir 12 microgramos de pSUmC-4.0 más brazos de homología al tubo y mezclar suavemente la solución parpadeando.
Incubar el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos parpadeando para mezclar cada 10 minutos. Agregue la solución de transformación a 24 mililitros de HBSS y mezcle pipeteando suavemente. Transfiera dos mililitros del inóculo a cada pozo de células Decoy confluentes en las placas de seis pozos.
Infectar por centrifugación a 900 g durante una hora a 20 grados centígrados. Retire el inóculo y sustitúyalo por dos mililitros por medio de crecimiento RPMI número dos. Incubar las placas a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
Después de un mínimo de siete horas, pero no más de 12 horas, reemplace el medio por dos mililitros por pozo de medios de selección número uno. Continúe la incubación a 37 grados centígrados durante 48 horas desde el momento de la infección. Cosecha y pasa las bacterias a una monocapa fresca de células McCoy usando un rascador de células para raspar suavemente la monocapa McCoy para levantar las células en los medios.
Transfiera el material de cada pozo a un tubo de dos mililitros. Pele el material celular a más de 20.000 veces g en una microcentrífuga durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Después de desechar el sobrenadante, resuspender el pellet celular en un mililitro de HBSS por pipeteo suavemente.
Pele el pelado de los restos celulares a 200 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un pozo fresco de células McCoy confluentes. Agregue un mililitro adicional de HBSS a cada pozo para un volumen total de dos mililitros por pozo.
Infectar por centrifugación a 900 g durante una hora a 20 grados centígrados. Sustituya el inóculo por el medio de selección número uno inmediatamente después de la infección. Continúe transmitiendo las bacterias a una monocapa fresca de células McCoy cada 48 horas hasta que se detecten inclusiones rojas y verdes usando un microscopio invertido por epifluorescencia las 24 horas después de la infección.
Una vez detectadas las inclusiones rojas y verdes, continúe pasando la monocapa como antes de utilizar el medio de selección número dos. Continúe transmitiendo la monocapa hasta que se detecten inclusiones sólo verdes 24 horas después de la infección, lo que indica la pérdida del vector pSUmC-4.0 y la incorporación del casete de selección loxP en el genoma. Cosecha y congela las inclusiones verdes en SPG.
Enriquezca las inclusiones sólo verdes a un MOI de entre 0,5 y 1,0 y recoja las monocapas en AAP como se describe en el texto. Obtener alícuotas de 50 microlitros en tubos de 1,5 mililitros y congelar a menos 80 grados centígrados. Siembra una placa de cultivo de tejido de 384 pozos con células McCoy como se describe en el protocolo de texto.
Diluir una alícuota de bacterias sólo verdes en HBSS para lograr aproximadamente 50 HB por 20 mililitros. Transfiera el inóculo diluido a una bandeja de depósito. Retire el medio de la placa de 384 pozos de las células Confluentes McCoy moviendo firmemente toda la placa boca abajo en un contenedor de residuos.
Con una pipeta multicanal, añada 50 microlitros de C.trachomatis inoculum a cada pozo. Infectar por centrifugación a 900 g durante una hora a 20 grados centígrados. Retire el inóculo parpadeando y sustitúyalo con 50 microlitros por pozo de medios de crecimiento número dos.
Incubar la placa a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Después de incubar la placa durante cinco a 12 días, identifique los pozos individuales con inclusiones fluorescentes verdes utilizando un microscopio invertido de epifluorescencia o una plataforma de cribado de alto contenido. Cosecha pozos con inclusiones solo verdes raspando la monocapa con una punta P10.
Transfiera todo el contenido del pozo a un tubo que contenga dos mililitros de HBSS. Mezclar suavemente y aplicar los dos mililitros de inóculo a una monocapa McCoy confluente fresca en un plato de seis pozos para la infección. Enriquecer, congelar y titer las poblaciones clonales.
Confirmar la eliminación de genes específicos de C.trachomatis aislados clonalmente utilizando PCR cuantitativo. Repita el proceso de transformación utilizando el mutante C.trachomatis FRAEM aislado clonalmente, el vector pSU-Cre y el medio de selección número tres. Pasaje de la monocapa hasta que se detecten inclusiones de solo rojo que indiquen la pérdida del casete de selección.
Aísle clonalmente las inclusiones de solo rojo limitando la dilución en una placa de 384 pocillos como antes. Enriquezca las poblaciones clonales transmitiendo hasta un MOI de 0.1. Una vez enriquecido, reemplace el medio de selección por el medio de crecimiento número dos para iniciar la pérdida del vector pSU-Cre.
Aísle clonalmente las bacterias no fluorescentes como antes. Sin embargo, escanee manualmente la placa con un microscopio Brightfield para detectar inclusiones. Enriquecer y congelar las bacterias.
Pantalla para la cepa mutante utilizando PCR cuantitativo en tiempo real, hinchazón occidental y secuenciación de ADN del genoma completo como se describió anteriormente. Se muestran datos representativos en los que tmeA está dirigido a la deleción de genes. La cepa de eliminación de C.trachomatis tmeaA se genera utilizando FRAEM y la cepa C.trachomatis tmeA-lx se genera utilizando FLAEM.
Se muestran los números de copia de ADN relativos de tmeA y tmeB aguas abajo, gfp contenidos en el casete de selección pSUmC-4.0 y cre contenido en el vector pSU-Cre. Ambas cepas mutantes contienen una eliminación del locus tmeA. Sin embargo, tmeA-lx no contiene el casete de selección como se indica por la ausencia de ADN gfp.
La cepa mutante tmeA ha disminuido la expresión de tmeB como lo muestran los niveles de ARNm y proteínas. Cuando FLAEM se utiliza para generar la cepa mutante tmeA-lx, esa expresión de tmeB se restaura según lo detectado por los niveles de ARNm y proteínas. La construcción cuidadosa del vector pSUmC con brazos homológicos es esencial para la eliminación específica de genes.
Se debe tomar tiempo para asegurar un montaje vectorial preciso antes de la transformación del clamidial. FLAEM ha proporcionado a los investigadores una herramienta para estudiar genes específicos y realizar deleciones dirigidas sin haber disminuido la expresión de genes fuera de destino que pueden confundir estudios. Los mutantes de eliminación de C.trachomatis generados por FLAEM se pueden utilizar para estudiar una variedad de aspectos de la biología clamidial, incluidos los mecanismos de desarrollo y patógenos.
