Este trabajo fue financiado por la Asociación Americana del Corazón de Desarrollo Científico Grant 0635480N y los Institutos Nacionales de Salud de becas de investigación AI081220. BIC es apoyado por una Caballeros Templarios Eye Foundation beca de investigación.

Información general Protocolos se proporcionan para definir primero la dosificación de la mutágeno que conduce a una matanza 70% de los parásitos (protocolo 1). El siguiente procedimiento se ofrece para enriquecer los mutantes inducidos por el egreso de un grupo mutagenizado parásito (el protocolo 2, Figura 2). Esto es seguido por un protocolo para probar la incidencia de los mutantes de egreso en la piscina enriquecido, o para validar el fenotipo de salida en los mutantes individuales (protocolo 3). Finalmente, un protocolo se proporciona para generar clones individuales de parásitos de poblaciones enriquecidas por dilución limitante (protocolo 4). 1. La titulación de mutágeno Tenga cuidado especial, como guantes dobles, cuando se trabaja con compuestos altamente mutagénicos y líquidos. Recoger los desechos líquidos por separado para su correcta eliminación. <ol><li> Inocular T25 frascos de cultivo de tejidos confluentes con fibroblastos de prepucio humano (HFF), las células con 1 ml de taquizoitos lisadas y crecer 18-25 horas a 37 °; C bajo 5% de CO 2 en Ed1 medio (D-MEM suplementado con inactivado por calor 1% de suero fetal bovino, 0,2 mM de L-glutamina, 50 U / ml de penicilina, estreptomicina 50 mg / ml, y 0,25 g / ml de anfotericina B ). Véase Roos et al. para el crecimiento general y los medios de comunicación de las células HFF y parásitos 21. </li><li> Reemplazar con 10 ml de medio de 0,1% de suero bovino fetal medio (diluido 1:10 Ed1 en D-MEM) y dejar en humidificado incubadora a 37 ° C por debajo del 5% de CO 2 (denominado &quot;37 ° C incubadora&quot; de aquí en adelante) durante 10 minutos . </li><li> Añadir 0, 12,5, 25, 50, 100 o ENU l (1 archivo M en DMSO) o SEM (1 archivo M en DMSO) por frasco (diluciones mutágeno de trabajo será 1,25, 2,5, 5, y 10 mM, respectivamente). Añadir DMSO a 100 l por cada matraz. Incubar durante 4 horas en una incubadora a 37 ° C. </li><li> Lavar tres veces durante 10 segundos a temperatura ambiente mediante enjuague la monocapa con 10 ml de PBS frío (pre-enfriado a 4 ° C). </li><li> Añadir 5 ml de PBS, raspe la monocapa de suelta con una espátula de caucho (células scraper), pasar las células tomadas por raspado a través de una aguja de 26,5 g para eliminar físicamente al parásito de los fibroblastos (clip del eje fuera de la aguja con unas tijeras de trabajo pesado para no exponer a la aguja), y el filtro de 3,0 micras filtro de policarbonato. Pasajes múltiples agujas aumentará la eficacia de la liberación de los parásitos de la célula huésped. </li><li> Contar el parásito concentración utilizando un hemocitómetro. Deje que los parásitos se conforme con 5 minutos en el hemocytomer antes del conteo. </li><li> Diluir los parásitos a 10.000 parásitos por 3 ml de ED1 (de 10 ml 33.333 parásitos son necesarios). </li><li> Se inoculan un pocillo en una placa de 6 pocillos con 3 ml de los parásitos diluidas (que contiene 10.000 parásitos). Serie diluir los parásitos de 10 veces más de 3 pozos en un confluente placa de 6 pocillos con células HFF que contienen 2,7 ml Ed1 mediante la transferencia de 300 l del primer pozo. Deja placas vírgenes en la incubadora a 37 ° C durante 7 días. </li><li> Aspirar medio, fijar 15 minutos con 3 ml / pocillo etanol 100%, manchacon 3 ml / pocillo solución violeta cristal (12,5 g de cristal violeta en 125 ml de etanol se mezcla con 500 ml de oxalato amónico al 1%) durante 15 minutos, enjuague con 3 ml / pocillo de PBS (1 minuto) y aire seco. Todo a temperatura ambiente. </li><li> Contar placas y seleccionar concentración del mutágeno necesaria para lograr una supervivencia de 30% de los parásitos expuestos (70% de destrucción de dosificación: véase la Figura 1). Una dosis de 70% de muerte se ha utilizado históricamente 14 e indujo a menos de 100 mutaciones puntuales por genoma (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manuscrito presentado). </li></ol> 2. Enriquecimiento de mutantes salida (Figura 2) <ol><li> Realizar mutagénesis como se ha descrito anteriormente, utilizando una dosis mutágeno inducir 70% matanza. Crece la población mutado por un pasaje en un nuevo frasco de las células huésped. </li><li> Infectar a un T25, HFF confluentes frasco de cultivo de tejidos con 120.000 recién parásitos lisados ​​de una población mutado en 10 ml Ed1. Incubar durante 2 horas en una incubadora 35 ° C bajo 5% de CO2 y húmeda (en adelante denominado &quot;incubadora de 35 ° C&quot;). </li><li> Aspirar medio y enjuague de 10 segundos con 10 ml de PBS frío y luego añadir 10 ml Ed1 medio suplementado con 25 mg / ml de sulfato de dextrano (DS) 13. Incubar durante 26 horas en una incubadora de 40 ° C por debajo del 5% de CO 2 y humidificado (en adelante denominado &quot;incubadora de 40 ° C&quot;). </li><li> Prepare la solución de trabajo de los potenciadores de salida. Diluir el inductor de salida de elección en la concentración de trabajo en un tubo Falcon de 15 ml que contenía 10 ml HBSSc suplementado con 25 mg / ml de DS. Pre-caliente las diluciones de 30 minutos en un baño de agua a 37 ° C. Ver Tabla 1 para las concentraciones de trabajo. </li><li> Aspirar medio de los matraces infectados por el parásito y añadir pre-calentado solución inductor de salida. Incubar en la incubadora a 37 ° C durante los tiempos indicados en la Tabla 1. </li><li> Aspirar medio y enjuague de 10 segundos con 10 ml de PBS frío y luego añadir 10 ml Ed1 suplementado con 25 mg / ml y DS 50 mM pirrolidina ditiocarbamato (PDTC: anunciod 5 l de 100 mM de archivo PDTC en PBS) 13. Incubar 5 horas en una incubadora 35 ° C. </li><li> Aspirar a medio y enjuague de 10 segundos una vez con 10 ml de PBS (temperatura ambiente) y, a continuación añadir 10 ml Ed1 medio. Ponga frascos de nuevo en la incubadora de 35 ° C hasta que los parásitos destruyen la monocapa: matraces de agitación diaria. Esta recuperación toma alrededor de 7 días. </li></ol> 3. La validación de fenotipos mutantes mediante ensayos de egreso Después de realizar la pantalla de enriquecimiento y crecimiento de la población enriquecida por un pasaje en células HFF, los fenotipos necesitan ser confirmados por un ensayo de salida 11,13. Este ensayo también se debe utilizar para validar los clones individuales después del Protocolo n º 4. <ol><li> Inocular 20.000 parásitos por pozo en una placa de 24 pocillos que contenía células confluentes cultivadas en cubreobjetos HFF (1 ml Ed1 medio por pocillo). Incubar 8 horas en una incubadora 35 ° C y después transferir en una incubadora 40 ° C durante 24 hrs. </li><li> Lavar con 1 ml / pocillo de PBS (10 segundos a temperatura ambiente). Añadir 1 ml inductores de egreso (incluye un solo DMSO control negativo), pre-calentado y se diluye en HBSSc e incubar durante los tiempos que se describen en la Tabla 1. </li><li> Aspirar medio y fijar con 1 ml / pocillo de metanol al 100% durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Si los parásitos de padres que expresan una proteína autofluorescente fueron utilizados para la mutagénesis, vaya al paso # 3.5 13. Si no fluorescentes parásitos que expresan la proteína se utiliza como línea principal, mancha los cubreobjetos fijos con Diff-Quick teñir durante 1 minuto a temperatura ambiente 11. </li><li> Lavar 5 minutos con 1 ml / pocillo de PBS en la placa de 24 pocillos a temperatura ambiente. </li><li> Para los parásitos que expresan proteínas fluorescentes: enjuagar rápidamente el cubreobjetos en ddH2O (inmersión) y montar en las diapositivas en gelmount para proteger la señal de fluorescencia. Para Diff-Quick parásitos manchadas, lavar 10 segundos en el 100% de etanol y dejar secar al aire antes de montar en la diapositiva. </li><li> Utilizando un microscopio (fluorescencia) con un40-60x objetivo contar el porcentaje de vacuolas egresados ​​frente a las vacuolas que permanecían intracelular (ver Figura 4). </li></ol> 4. Clonar mutantes de egreso por dilución límite Después de la validación del fenotipo de la población enriquecida de salida mutante utilizando el protocolo de 3, la población policlonal tiene que ser clonados para obtener clones individuales de parásitos. <ol><li> Contar población de parásitos en un hemocitómetro y se diluye hasta una concentración de 500 parásitos por ml en medio Ed1. </li><li> En una placa de 384-bien que contiene una monocapa confluente de células HFF, reemplazar el medio con 40 l / pocillo de Ed1 medio utilizando una pipeta de canales múltiples. Como se muestra en la Figura 5, cuatro poblaciones policlonales pueden ser clonados por placa como sigue: pipeta 40 l / pocillo de diluida mutante 1 en pocillos de C3-C12, mutante 2 en pocillos C13-C22, mutante 3 en los pocillos H3-H12, y mutante 4 en los pozos H13-H22 (volumen final en los pozos es ahora 80 l). El uso de un multi-canal de la pipeta, la pipeta del sollución arriba y hacia abajo 5 veces, a continuación, transferir 40 l de la fila debajo de la fila de partida (de la fila C a D o H fila I). Continuar estas diluciones en serie 2-plegado a través de la fila G (mutantes 1 y 2) o fila N (mutantes 3 y 4). Deseche el extra de 40 l de la última fila. Incubar en una incubadora 35 ° C durante 7-10 días sin perturbar la placa. </li><li> Ver los pocillos en un microscopio invertido con un objetivo 10-20x para la presencia de placas individuales, visible como &#39;agujeros&#39; en la monocapa. </li><li> Pick 4 pocillos por mutante con una sola placa y transferir los parásitos en un frasco de cultivo confluente tejido con células HFF y lleno de Ed1 medio. Crecer los parásitos en una incubadora de 35 ° C y agitar los frascos diarios para dispersar a los parásitos extracelulares. Esto suele tardar 7 días. </li></ol> 5. Los resultados representativos El ENU mutágenos y EMS no son estables cuando se almacenan durante largos períodos de tiempo. Por lo tanto, poniendo a prueba el poder mutagénico delas poblaciones es fundamental para obtener resultados reproducibles. Los resultados típicos de valoración y matar las curvas tanto para ENU y EMS se muestra en la Figura 1. Sin embargo, se recomienda llevar a cabo ensayos de placa para cada experimento de mutagénesis para determinar la dosificación apropiada que se utilizó. Para mantener la diversidad en la población de parásitos mutagenizado, es importante para proceder con la pantalla mutante salida lo más rápidamente posible. Por lo general, un pasaje de los parásitos en un nuevo frasco se lleva a cabo para permitir que los parásitos supervivientes se recuperen antes de seguir adelante con la pantalla. Se debe tener en cuenta que haciendo esto dará como resultado la división de los mutantes. Por lo tanto, no puede excluirse que varios mutantes aislados clonales después de completar el procedimiento en su conjunto contienen exactamente el mismo genotipo. Para evitar el aislamiento de los mismos tiempos de mutantes múltiples, se recomienda aislar sólo un mutante de salida única por mutagénesis, a menos que sus fenotipos (por ejemplo, la sensibilidad diferencial inductor de salida) sonmuy diferentes entre sí. Por otro lado, no todos los resultados de la pantalla en el aislamiento de mutantes con el fenotipo deseado. En particular, el Ca 2 +-ionóforo A23187 fenotipo de resistencia es poco frecuente y requiere de múltiples experimentos de mutagénesis y pantallas para aislar un mutante de salida única. Por lo tanto, se recomienda realizar mutagénesis 10.05 y los experimentos de la pantalla en paralelo. El poder de enriquecimiento de la pantalla se ensayó mediante la mezcla de un mutante de salida conocido con parásitos de tipo salvaje en diferentes proporciones. Estas mezclas se sometieron a la pantalla y la incidencia del fenotipo mutante en la población enriquecida se evaluó. Mediante el uso de tipo salvaje parásitos que expresan RFP citoplasmática y una línea mutante que expresa YFP citoplasmática las incidencias rápidamente se pudo establecer mediante citometría de flujo (Figura 3) 13. Los resultados muestran que los fenotipos mutantes puede ser rutinariamente enriquecido al 80% de pureza, comenzando con parásito salida 1 mutante por 10.000 de tipo salvaje parasites 13. Sin embargo, cuando la salida mutante: tipo salvaje relación de arranque parásito es 1:100.000 parásitos, la población aislada es sólo el 1-2% (1:100) mutantes de salida. Por lo tanto el poder de enriquecimiento de la pantalla es 1.000 veces. Puesto que la pantalla se inicia con la inoculación de 120.000 parásitos, de los cuales típicamente 70% son viables, se suelen realizar dos rondas de enriquecimiento. Los parásitos aislados han crecido entre las dos rondas de enriquecimiento. Este procedimiento da lugar a una población de 100% mutante, incluso cuando a partir de 1:1.000.000 de egreso: mutantes de tipo salvaje parásitos. El ensayo de salida para validar y caracterizar los fenotipos requiere una multiplicidad de infección de la célula huésped que permite la diferenciación de vacuolas individuales. Esto es especialmente importante cuando se analizan las condiciones con altos porcentajes de egreso ya que los parásitos individuales están esparcidos alrededor. Como se muestra en la Figura 4, si las poblaciones egresados ​​no están bien separadas es fácil subestimar el porcentajede salida contando dos vacuolas egresados ​​como una vacuola. Desde salida y la invasión son procesos relacionados, y algunos fenotipos sensibles a la temperatura mostrar un fenotipo leve a la temperatura más baja, no todos los mutantes tienen eficiencias similares invasión. Estos mutantes por lo tanto, deben ser inoculados en varias veces mayores dosis para obtener una alta densidad vacuola suficiente para una evaluación precisa de su fenotipo de salida. Por otra parte, algunos inductores de egreso no son eficientes estimular la salida de los cuatro parásitos que contienen vacuolas o menos. Como tal, es importante que las vacuolas contienen ocho parásitos o más cuando se inicia el ensayo de salida. En nuestro laboratorio hemos aislado mutantes de la pantalla con un intensificador particular en contra de salida potenciadores de egreso otros. Al presentar su reactividad cruzada de los mutantes se pueden agrupar en diferentes categorías. Por último, no todos los mutantes de egreso será sensible a la temperatura. En particular, los mutantes aislados con inductores de egreso de disparo pasos antes de la liberación de intracellular Ca 2 + son propensos a no fenotipos sensibles de temperatura. Esto es debido a los caminos paralelos que pueden conducir a la salida antes de la señal converge sobre la liberación de Ca 2 + intracelular. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig1.jpg" /> Figura 1. Químico mutágeno titulación de dosificación. Ensayos de A. La placa realizada en una placa de 6 pocillos utilizando diferentes concentraciones de EMS y números diferentes de parásitos por pozo, como se indica. Las manchas blancas son parásitos placas formadas en la monocapa HFF. B, C. curvas de supervivencia de los parásitos a la exposición a diversas dosis de EMS (B) y ENU (C). La supervivencia fue evaluada por ensayos de placa. Una dosis inducir 70% matanza se elige para experimentos de mutagénesis. Los promedios de tres experimentos independientes + / - desviación estándar se muestran. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. Representación esquemática de la pantalla de enriquecimiento mutante salida. La temperatura se indica en el eje, mientras que la progresión de tiempo está representado por el eje x. Parásitos verdes reflejan egreso parásitos mutantes, parásitos rojos reflejan los parásitos de tipo salvaje. El momento de cambios en las condiciones y la estimulación de inductor de salida se indican en la parte superior y están marcados por las flechas en la línea azul que refleja el perfil de temperatura. Adoptado de Eidell et al. 13. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig3.jpg" /> Figura 3. Típico de enriquecimiento de egreso fenotipos mutantes. Resultados de enriquecimiento de un mutante de salida mezclada en los de tipo salvaje parásitos en diferentes proporciones (eje X). El porcentaje de egreso fenotipos mutantes en la población creció después de la pantalla se dibuja en el eje y, y se evaluó por citometría de flujo (de egreso parásitos mutantes expresó YFP citoplasmática, de tipo salvaje parásitos expresó cytoplasmic RFP). Los resultados de tres experimentos independientes están representados por puntos de datos de color rojo, azul y verde. Adoptado de Eidell et al. 13. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig4.jpg" /> Figura 4. Los resultados típicos de un ensayo de salida. A Flechas. Marcar cuatro diferentes vacuolas que contienen parásitos intactos 4-8. B. Las flechas señalan cuatro grupos de parásitos aislados que reflejan cuatro vacuolas egresados ​​independientes. Egreso fue inducida por A23187 (B) o DMSO como un control negativo (A). Los parásitos expresar citoplasmática YFP 22. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3807/3807fig5.jpg" /> Figura 5. Diluciones seriadas de las líneas clonales de parásitos. Cuatro poblaciones policlonales (rojo, azul, amarillo, verde) se diluyen en serie en una sola placa confluente de 384 pocillos con células HFF. Fila C y recibo 10 parásitos por pozo yson 2-veces diluido (40 l + 40 l) hasta que las filas H y N, respectivamente. El tono de gris indica la disminución del número de parásitos por pozo. Típicamente, los clones individuales se encuentran en filas DF y JL. <table border="1"><tbody><tr><td> Compuesto </td><td> Valores </td><td> Concentración de Trabajo </td><td> l necesaria para T25 (10 ml) </td><td> Tiempo de incubación (min) </td></tr><tr><td> TDT </td><td> 1 M en DMSO </td><td> 5 mM </td><td> 50 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> etanol </td><td> 190 Prueba </td><td> 5% </td><td> 500 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> A23187 </td><td> 2 mM en DMSO </td><td> 1 mM </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> nigericina * </td><td> 2 mM en DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 50 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> * Nigericina no puede ser utilizado en el enriquecimientopantalla de ambiente como los parásitos no sobreviven a la estimulación nigericina, usar solamente nigericina en la validación de los mutantes de salida. Tabla 1. Egress inductores utilizados en los procedimientos. Diluir en 10 ml HBBSc contiene 25 mg / ml para la pantalla de DS o DS no para la validación de mutante (prueba de salida). Todos los compuestos de Sigma-Aldrich.

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+selective+killing+of+extracellular+parasites+by+oxidation+using+pyrrolidine+dithiocarbamate.">Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate.</a> Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).</li><li>Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+growth+assay+for+Toxoplasma+gondii+using+yellow+fluorescent+protein.">High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).</li><li>Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+approach+to+studying+invasive+mechanisms+of+Toxoplasma+gondii.">A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).</li><li>Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+modeling+of+Toxoplasma+gondii+invasion.">Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion.</a> J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).</li><li>Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+distribution+of+structural+mutants+in+ethylnitrosourea-treated+cultured+human+lymphoblastoid+cells.">Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).</li><li>Kafsack, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+membrane+disruption+by+a+perforin-like+protein+facilitates+parasite+exit+from+host+cells.">Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells.</a> Science. 323 (5913), 530-533 (2009).</li><li>Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+microneme+secretion+involves+intracellular+Ca(2+)+release+from+inositol+1,4,5-triphosphate+(IP(3))/ryanodine-sensitive+stores.">Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores.</a> J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).</li><li>Nagamune, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abscisic+acid+controls+calcium-dependent+egress+and+development+in+Toxoplasma+gondii.">Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii.</a> Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).</li><li>Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Externally+triggered+egress+is+the+major+fate+of+Toxoplasma+gondii+during+acute+infection.">Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection.</a> J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).</li><li>Persson, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+receptor+ligation+or+exposure+to+perforin+trigger+rapid+egress+of+the+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii.">Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

<html> El protocolo descrito proporciona un método eficiente para aislar mutantes Toxoplasma con un defecto de salida. Hemos aislado con éxito mutantes a lo largo de diversas etapas de la vía de salida, algunos de los cuales tienen un fenotipo invasión de doble 13. Los efectos potenciales sobre la invasión se puede determinar utilizando el llamado ensayo de rojo-verde, que distingue invadido de no invadido por parásitos tinción diferencial anticuerpo 23,24. Para ambos ensayos de inva...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> ENU </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N3385 </td><td> 1 M en DMSO, almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> EMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0880 </td><td> 1 M en DMSO, almacenar a -20 ° C </td></tr><tr><td> El sulfato de dextrano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D4911 </td><td></td></tr><tr><td> PDTC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8765 </td><td> 100 mM de archivo en PBS </td></tr><tr><td> Diff Quick </td><td> Merck Chemicals </td><td> 65044-93 </td><td></td></tr><tr><td> El soporte del filtro </td><td> Cole-Parmer </td><td> 540100 </td><td></td></tr><tr><td> 3 micras filtro de policarbonato </td><td> WhatmanSchleicher y Schuell </td><td> 110612 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocitómetro </td><td> Hausser Científico </td><td> 1475 </td><td></td></tr><tr><td> Incubadoras de CO 2 </td><td> Varios fabricantes </td><td></td><td> CO humidificado, 5% 2, en 35, 37 y 40 ° C </td></tr><tr><td> Microscopio de fluorescencia </td><td> Varios fabricantes </td><td></td><td> Lo ideal sería invertido, de gran campo con el objetivo de aceite de 63x o 100x </td></tr></tbody></table> HBSSc (de acuerdo con Negro et al 11.): <ul><li> 98,0 ml de solución salina equilibrada de Hanks (número de catálogo SH30588 Hyclone) </li><li> 100 l de MgCl 1M 2 (100 mM final) </li><li> 100 l de CaCl 1M 2 (100 mM final) </li><li> 2,0 ml de Hepes 1 M pH 7,3 (20 mM final) </li><li> 84 mg de NaHCO 3 (10 mM final) </li></ul>

a genetic screen to isolate toxoplasma gondii host-cell egress mutants

La generalizada, intracelular obligado, protozoo parásito Toxoplasma gondii causa la enfermedad oportunista en pacientes inmunocomprometidos y causa defectos de nacimiento después de la infección congénita. El ciclo de replicación lítica se caracteriza por tres etapas: 1. invasión activa de una célula huésped nucleada; 2. replicación dentro de la célula huésped; 3. salida activa de la célula huésped. El mecanismo de salida está cada vez más apreciado como un proceso único, altamente regulado, lo que aún es poco conocido a nivel molecular. Las vías de señalización que subyacen salida se han caracterizado mediante el uso de agentes farmacológicos que actúan sobre los diferentes aspectos de las vías de 1-5. En este sentido, varios disparadores independientes de egreso se han identificado que todos convergen en la liberación de Ca 2 + intracelular, una señal de que también es crítico para la invasión de la célula huésped 6-8. Esta visión informó a un enfoque de genes candidatos que llevó a la identificacióncación de la planta como el calcio de la proteína quinasa dependiente (CDPK) que participan en salida 9. Además, varios avances recientes en la comprensión de salida se han realizado utilizando (química) los enfoques genéticos 10-12. Para combinar la riqueza de la información farmacológica con el aumento de la accesibilidad genética de Toxoplasma hemos establecido una pantalla que permite el enriquecimiento de los parásitos mutantes con un defecto en la salida de la célula huésped 13. Aunque mutagénesis química utilizando N-etil-N-nitrosourea (ENU) o metanosulfonato de etilo (EMS) se ha utilizado durante décadas en el estudio de la biología Toxoplasma 11,14,15, sólo recientemente se ha mapeo genético de las mutaciones que subyacen a los fenotipos convertido en una rutina 16 -18. Por otra parte, mediante la generación de mutantes sensibles a la temperatura, los procesos esenciales pueden ser analizados y los genes subyacentes identificados directamente. Estos mutantes se comportan como de tipo salvaje en la temperatura permisiva (35 º C), pero no proliferate a la temperatura restrictiva (40 ° C) como un resultado de la mutación en cuestión. Aquí se ilustra un nuevo método de cribado fenotípico para aislar mutantes con un fenotipo sensible a la temperatura de salida 13. El reto para las pantallas de egreso es separar egresados ​​de la no-egresados ​​parásitos, lo cual es complicado por la rápida re-invasión y la rigidez general de los parásitos de las células anfitrionas. Una pantalla de salida previamente establecida se basa en una serie de pasos engorrosos biotinilación para separar intracelular de parásitos extracelulares 11. Este método también no generar mutantes condicionales resultan en fenotipos débiles. El método descrito aquí supera la fuerte adhesión de egressing parásitos mediante la inclusión de un competidor glicano, sulfato de dextrano (DS), que impide que los parásitos se pegue a la célula huésped 19. Por otra parte, los parásitos extracelulares son específicamente exterminados por pirrolidina ditiocarbamato (PDTC), lo que deja los parásitos intracelularessanos y salvos 20. Por lo tanto, con una nueva pantalla fenotípica para aislar específicamente mutantes con defectos en el parásito de salida inducida por el poder de la genética ahora se puede estar totalmente desplegado para desentrañar los mecanismos moleculares subyacentes de salida de la célula huésped.

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A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Adelante la genética es un poderoso método para desentrañar el nivel molecular de cómo<em&gt; Toxoplasma</em&gt; Egresados ​​de su célula huésped. Protocolos se proporcionan para mutagenizar químicamente parásitos, enriquecer a los mutantes con defectos en la salida inducida, y validar el fenotipo de los mutantes clonados.

Una pantalla genética para aislar Toxoplasma gondii Célula huésped-mutantes Egress

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

12.9K vistas.  Boston College. Adelante la genética es un poderoso método para desentrañar el nivel molecular de cómo Toxoplasma Egresados ​​de su célula huésped. Protocolos se proporcionan para mutagenizar químicamente parásitos, enriquecer a los mutantes con defectos en la salida inducida, y validar el fenotipo de los mutantes clonados.

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Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

Obtener altamente purificada Toxoplasma gondii Los ooquistes por un gradiente de cloruro de cesio discontinua

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Investigación

Inmunología e Infección

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Quiste Toxoplasma gondii Muro de Formación en Activado médula ósea procedentes de los macrófagos y Condiciones bradizoíto

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

Los ratones con Transnuclear predefinidos Especificidades receptor de células T contra la Toxoplasma gondii Obtenidos a través de la SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

El uso de un ensayo de microarrays Pan-viral (Virochip) a la pantalla de muestras clínicas de los patógenos virales

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

El establecimiento de un cultivo líquido cubierto de las vías respiratorias humanas epiteliales polarizadas Calu-3 células para estudiar la respuesta del huésped celular a patógenos respiratorios<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

La manipulación genética en<em&gt; Δku80</em&gt; Las cepas de Análisis Genómico Funcional de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Usando Click Química para medir el efecto de la infección viral en el Host-Cell ARN Síntesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Adelante Genética pantallas usando macrófagos identificar<em&gt; Toxoplasma gondii</empara la resistencia a IFN-γ por células dependiente&gt; Genes Importante Inmunidad Autónoma

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

El uso de la técnica de superposición Soft-agar para la detección de compuestos inhibidores en bacterias producidas

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is that they may induce traumatic lesions on the surface of the eye, which can progress to scarring, eyelid deformity, limbal stem cell deficiency and in some cases, cause great discomfort to the subject. To avoid these clinical problems, impression cytology (IC) was developed to diagnose dry eye disease and later neoplasia, atopic disease, vernal keratoconjunctivitis and keratoconjunctivitis sicca. Typically, clinicians manually cut filter papers into required shapes and apply these to the ocular surface. Here, we describe how to perform IC using a commercially available medical device. This technique is explained here followed by immunophenotyping by flow cytometry. This technique requires less manual handling and causes less injury to the ocular surface.

The exposed normal ocular surface consists of cornea and conjunctiva. Epithelial cells, goblet cells and immune cells are present in the conjunctiva. Here, a non-invasive, technique of impression cytology is described using an impression cytology device and flow cytometry to analyze immune cells in the conjunctiva.

Una forma no invasiva de aislar y células fenotípicas de la conjuntiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...