Este método qRT-PCR puede abordar preguntas relacionadas con el perfil de expresión de microARN en suero de ratones en condiciones tales como insuficiencia renal dependiente de la edad. La técnica permite la detección de la expresión de microARN con alta precisión y sensibilidad mediante un proceso simple que ahorra tiempo y evita errores técnicos. Para comenzar, incise la piel del abdomen con pinzas y tijeras quirúrgicas.
Corte los músculos de la membrana peritoneal desde la vejiga hasta el borde inferior izquierdo de las costillas. Levante la membrana peritoneal con pinzas y haga una incisión lateral en el borde superior con tijeras quirúrgicas. Continúe la incisión a lo largo del borde más bajo de las costillas.
Identifique la vena cava inferior mediante el uso de dos hisopos de algodón humedecidos con PBS. Inserte una aguja de 30 G conectada a una jeringa de 1 mililitro en la vena cava inferior y tire de la jeringa. Tire lentamente de la aguja para evitar la hemólisis.
Transfiera la sangre a un tubo de spitz de 1 mililitro con heparina y mezcle invirtiendo. Centrifugar el tubo de spitz durante 10 minutos a 3000 veces G a temperatura ambiente. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 mililitros.
Tome 200 microlitros de muestra de suero y agregue 1, 000 microlitros de reactivo de lisis a base de fenol / guanidina. Vortex la mezcla durante 5 segundos e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Agregue 200 microlitros de cloroformo y mezcle invirtiendo el tubo 15 veces.
Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 3 minutos, seguida de centrifugación. Sin alterar el pellet, transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 mililitros. Agregue 450 microlitros de etanol al 100% y voltee el tubo durante 5 segundos.
Luego cargue 700 microlitros de la muestra en una columna de centrifugado anclada a la membrana y centrifugarla. Deseche el flujo y agregue 700 microlitros de Wash Buffer 1 provisto en el kit. Centrifugar de nuevo y desechar el flujo.
Repita el lavado con 500 microlitros de Wash Buffer 2 para eliminar las sales traza. Agregue 500 microlitros de etanol al 80%, centrifugar y deseche el flujo del tubo de recolección. Centrifuga la columna de centrifugado de nuevo y transfiera la columna a un tubo de recolección fresco de 1,5 mililitros.
Luego agregue 14 microlitros de agua libre de RNasa e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. Gire la columna de nuevo durante 1 minuto a 15000 veces G a temperatura ambiente. Prepare una solución de mezcla maestra y agregue 8 microlitros por pocillo en un tubo de tira de 8 pocillos.
Agregue 12 microlitros del ARN total extraído en cada tubo y centrifugue el tubo durante 15 segundos a 2000 veces G a temperatura ambiente. Coloque el tubo en un termociclador y comience la incubación para sintetizar el ADNc. Después de la incubación, transfiera el ADNc a un tubo de microcentrífuga nuevo.
Diluir el ADNc diez veces con agua destilada. Luego vórtice, seguido de centrifugación durante 5 segundos a 2000 veces G a temperatura ambiente. En un tubo de microcentrífuga, prepare la solución de mezcla maestra como se describe en el protocolo de texto y haga un vórtice de la solución.
Agregue alícuotas de 22.5 microlitros en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, seguido de 2.5 microlitros de ADNc. Selle la placa con una película adhesiva y centrifugue la placa durante 30 segundos a 1000 veces G.Coloque la placa en el sistema de PCR en tiempo real. Modifique la configuración proporcionando un nombre para el experimento.
Luego seleccione 0.2 mililitros de 96 pocillos como el tipo de experimento, CT comparativo como método de cuantificación, estándar como el modo de funcionamiento del sistema y reactivos SYBR Green como los reactivos para detectar la secuencia objetivo. Proporcione nombres para la muestra y el miARN objetivo en cada pocillo. Asigne muestras duplicadas, elija una muestra de referencia y un control endógeno, y seleccione ninguna para que el tinte la use como referencia pasiva.
Para eliminar la contaminación cruzada de reactivos, configure una transcriptasa inversa negativa y un control sin plantilla para la expresión de miARN. A continuación, asegúrese de que el volumen de reacción se ajuste a 20 microlitros, y las condiciones de ciclo de PCR se establecen en 95 grados centígrados durante 15 minutos, luego 40 ciclos de desnaturalización a 94 grados centígrados durante 15 segundos, recocido a 55 grados centígrados durante 30 segundos y extensión a 70 grados centígrados durante 30 segundos. Una vez completado el proceso, haga clic en analizar para analizar los datos de qRT-PCR.
Confirme que la línea de umbral seleccionada automáticamente por el programa es apropiada para cada pozo. Compruebe el valor umbral del ciclo de los miRNAs de control endógeno y diana analizados en cada muestra. Determine los valores de CT mediante la intersección de la curva de amplificación y la línea umbral.
Los datos de miRNA qRT-PCR para el modelo de insuficiencia renal dependiente de la edad mostraron que, en comparación con los ratones control SAMR1, el nivel renal de miRNA-7219-5p aumentó significativamente en ratones experimentales SAMP1, mientras que el nivel renal de miRNA-7218-5p disminuyó. Los niveles de expresión de miRNA-223-3p no cambiaron en ninguna de las cepas. Los niveles séricos de miRNA-7219-5p y miRNA-7218-5p aumentaron considerablemente en los ratones SAMP1, mientras que los niveles de miRNA-223-3p se mantuvieron sin cambios.
Debe insertar la aguja en la vena cava inferior y extraer sangre sin penetrar en el vaso. Este método se puede utilizar para responder preguntas clave en el perfil de expresión de microARN en suero de ratones para una amplia gama de condiciones patológicas.
