Hola. Así que este es un pequeño protocolo norte de ARN. Es una derivada del protocolo originalmente optimizada por Dr.Rashid Akbergenov.
En este método, se pueden detectar pequeños ARN de entre 20-24 nucleótidos de longitud, con mucha precisión y a muy alta resolución. El protocolo es básicamente una forma modificada de análisis tradicionales del norte, pero aquí, el porcentaje de acrilamida es bastante alto, es 15 por ciento. Este norte se puede utilizar para detectar EL ARN pequeño ya conocido, ya sea micro ARN u otro conjunto de ARN pequeño, cuando se conoce la secuencia o se puede utilizar para la confirmación de la abundancia de ARN pequeño procedente de conjuntos de datos de secuenciación de próxima generación.
La ventaja de este método es que, no sólo se puede mirar la abundancia de micro ARN, sino también la abundancia de precursores, por ejemplo micro ARN puede dejar fuera un precursor que es alrededor de 30 para que puede ser unos pocos cientos de nucleótidos de largo, esto también se puede detectar simultáneamente, junto con el micro ARN. El protocolo es muy simple, muy sencillo, pero uno tiene que ser muy cauteloso mientras se realizan algunos pasos críticos que se enumeran al final de este protocolo. Para la preparación de la mezcla de gel de 10 ml, añadir 4,8 gramos de urea, 3,75 ml de 40% de solución de acrilamida y 1 ml de 10X TBE recién preparado, pH 8.2 y mezclar suavemente la solución.
Disolver la urea por completo, calentando la mezcla en un baño de agua, hasta que la solución se vea clara. Infórrele el volumen a 10 ml, utilizando agua MilliQ estéril y enfríe la mezcla de gel a temperatura ambiente. Lave el aparato necesario con detergente, frote suavemente para eliminar el TBE residual y la acrilamida.
Enjuáguelos aún más con agua MilliQ y deje que se seque. Montar la placa de vidrio juntos, asegúrese de que ambos están en el mismo nivel. Colóquelos firmemente sobre la esponja.
Añadir 8 micro litros de TEMED y 80 micro litros de APS 10% recién preparado a la mezcla de gel. Mezcle y vierta suavemente la mezcla de gel en las placas ensambladas. Asegúrese de que el gel no se filtre.
Coloque el peine con cuidado. Deje que el gel se polimerice durante aproximadamente 45 minutos. Después de la polimerización del gel, retire las placas de vidrio del conjunto.
Lave las placas de vidrio con agua MilliQ. Y colóquelos en el casete de running. Coloque el cassette de carrera dentro del tanque.
Verter 1X TBE recién preparado, pH 8.2. Retire el peine con cuidado. Lave bien los recipientes del gel pipeteando el tampón.
Este paso elimina los precipitados de urea del pozo y facilita el ARN para que funcione uniformemente a través del gel. Cierre la tapa del aparato y pre-ejecute el gel vacío a 80 voltios durante 30 minutos, para comprobar si hay fugas de tampón. Para la preparación de un tinte de carga de 10 ml, pesar 5 mg de bromofenol azul, 5 mg de cianol de xileno y añadir 10 ml de forma desioninizadamidamida y mezclarlos bien.
Aliquot el tinte y almacenar a 4 grados para su uso posterior. Aliquot 10 microgramos de ARN total en tubos estériles de 1,5 ml. Asegúrese de que la calidad del ARN, es decir.
la relación 260:230 es mayor o más cercana a dos. Coloque el tubo dentro de una speedVac y seque al vacío las muestras. Vuelva a suspender las muestras de ARN seco en 8 micro litros de tinte de carga.
Calienta las muestras a 98 grados durante dos minutos. Enfríelos durante un minuto a temperatura ambiente. Vortex las muestras de ARN enfriadas para asegurar una suspensión adecuada en el tinte de carga.
Gira los tubos. Repita los pasos de calentamiento, enfriamiento y vórtice tres veces para obtener ARN de flujo libre. Detenga la pre-ejecución del gel.
Lavar bien los pozos, antes de cargar la muestra, para eliminar los depósitos de la urea dentro de los pozos. Caliente las muestras de ARN re-suspendidas a 98 grados durante un minuto. Cargue las muestras calientes en los pozos utilizando puntas capilares.
Evite introducir burbujas de aire. Carga completa de todas las muestras y montar la tapa. Ejecuta el gel a 80 voltios durante tres horas o hasta que el bromofenol azul funcione por completo.
Utilice una membrana de nylon cargada positivamente para la transferencia. Cortarlo a las dimensiones de la placa de vidrio. Etiquete la membrana en su esquina superior derecha.
Coloque suavemente la membrana en la superficie del agua MilliQ estéril asegúrese de colocar el lado de la etiqueta hacia abajo, mirando hacia la superficie del agua. Tome una bandeja limpia y prepare el sándwich de gel para la transferencia de electro. Coloque el lado gris del cassette hacia abajo.
Vierta 1X TBE ligeramente por encima del nivel del cassette. Humedezca previamente la almohadilla de fibra en 1X TBE y apriétela para eliminar las burbujas de aire. Corte dos trozos de papel hinchado al tamaño de la almohadilla de fibra.
Pre-mojar un pedazo de papel hinchado en 1X TBE y colóquelo sobre la almohadilla de fibra. Retire las burbujas de aire rodando una pipeta de plástico sobre el papel. Pre-mojar otro pedazo de papel hinchado en 1X TBE y lo ponga sobre el cassette.
Pase el rollo para eliminar las burbujas de aire. Ahora la configuración del sándwich está lista para la transferencia de electro. Después de completar la electroforesis, detenga la carrera y retire la tapa del aparato.
Retire el cassette en ejecución de la configuración. Saque las placas de vidrio del cassette de running. Retire cuidadosamente el gel del conjunto.
Árloo sobre el papel hinchado de tal manera que la primera muestra de ARN cargada esté hacia su derecha. Sumerja suavemente la membrana pre-empapada en 1X TBE y colóquela sobre el gel, mirando hacia abajo. No deje que la membrana y el gel se sequen.
Rodar suavemente para eliminar la burbuja de aire. Sumerja un trozo de papel hinchado en 1X TBE y ártelo sobre la membrana. Retire las burbujas de aire.
Coloque otro pedazo de papel hinchado y retire las burbujas de aire. Complete el sándwich colocando la almohadilla de fibra sobre el conjunto. Cierre el cassette firmemente.
Coloque el cassette trans-blot en el módulo. Llene el tanque con 1X TBE, pH 8.2, hasta la marca de hinchazón. Cierre la tapa del aparato y transfiera a 10 voltios durante la noche a 4 grados o en una sala fría.
Mantenga listo el eslabón cruzado UV y establézcalo en 1200, justo antes de completar la transferencia de electro. Después de completar la transferencia, retire el cassette del módulo. Coloque la membrana húmeda en una hoja A4, colocando el lado marcado hacia arriba.
Une el ARN a la membrana mediante irradiación con luz UV de 254 nanómetros a 120 milímetros. La mancha reticulada puede almacenarse en cuatro grados o utilizarse para la hibridación. Diseñe una sonda que sea completamente gratuita al pequeño ARN que tiene que ser detectado.
Fin etiqueta la sonda en su extremo principal usando enzima PNK y combine los componentes como se muestra. Incubar la mezcla de reacción a 37 grados durante 30 minutos. Después de 30 minutos de incubación, utilice columnas G-25 para separar las sondas sin etiquetar de la mezcla de reacción.
Para mejorar el etiquetado de la sonda, prepare la columna G-25 antes de su uso. Coloque la mancha, lado ARN orientado hacia arriba, dentro de una botella de hibridación. Mezcle vigorosamente el tampón de hibridación antes de su uso.
Añadir 10 ml de tampón de hibridación en el interior y colocar la botella de hibridación dentro del horno de hibridación, mantener a 35 grados con rotación. Realice la pre-hibridación durante 20 a 30 minutos. Después de la pre-hibridación, retire la botella del horno.
Agregue suavemente la sonda etiquetada al búfer de hibridación. Asegúrese de que no se crean burbujas de aire. Incubar la mancha dentro del horno a 35 grados con rotación durante 12 horas.
Después de la hibridación, quite el búfer de hibridación de la botella. Realice un lavado rápido de las manchas, utilizando el buffer-I de lavado. Este paso se realiza para eliminar el exceso de solución de hibridación de las manchas.
Incubar aún más las manchas a 35 grados durante 30 minutos usando tampón de lavado I. Realice otro lavado con buffer-II a 35 grados durante 30 minutos. Después de lavar la mancha, colóquela dentro de una cubierta de hibridación, retire el exceso de tampón y ciéltelo.
Colóquelo dentro de un cassette y expongalo a una pantalla de fosfo-imagen libre de radiación durante 12 horas. Detecte la señal de hibridación utilizando el imager biomolecular tifones y analice los resultados utilizando el software ImageJ. Para la hibridación de la mancha con otros sondeos, realice los pasos de desmontaje como se ilustra.
Con esta técnica se puede estimar la abundancia de micro ARN, así como su longitud. A partir de esta imagen, la expresión del micro ARN 397 se puede detectar en todas las muestras. En esta mancha, la abundancia de muestra uno es de aproximadamente 5 lecturas por millón, según los datos de secuenciación de próxima generación, lo que sugiere que nuestra técnica puede detectar micro ARN menos abundantes también.
Además, mediante el uso del software de cuantificación ImageJ, se puede cuantificar la expresión de micro 397 entre las muestras. Aquí hemos utilizado U6 y micro RNA 168 como controles de carga. Voy a hablar de algunos pasos cruciales que deben ser considerados durante la realización del experimento.
Asegúrese de utilizar ARN de buena calidad para la preparación de muestras. Mientras seque al vacío las muestras, evite secarlas en exceso. La re-suspensión del ARN en el tinte de carga es fundamental.
Asegúrese de preparar una muestra de flujo libre. Se debe tener cuidado al cargar el gel. Los pozos del gel deben lavarse y la muestra debe cargarse en línea recta dentro de los pozos.
Durante la transferencia electro, la propagación de la membrana en agua, justo antes de sumergirla en 1X TBE es esencial, mejora la transferencia. La hibridación de la mancha debe realizarse a 35 grados. Mantener la temperatura del horno de hibridación.
Para el uso repetido de las manchas, las membranas deben almacenarse a 4 grados. Deben mantenerse húmedos en 2X SSE. A diferencia de otros métodos basados en PCR, este método garantiza la cuantificación de la expresión, así como la determinación del tamaño de los micro RNAs.
